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第一部分:LPS诱导的DNA双链断裂通过GATA4调节牙髓细胞的NF-κB信号通路目的:探究脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是否诱导牙髓细胞DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs),以及DSBs在牙髓细胞炎症反应中的作用机制。材料与方法:建立LPS诱导的大鼠实验性牙髓炎模型,分别对未处理组及炎症诱导后0天,2天,4天,6天,8天的大鼠牙髓组织进行y-H2A.X(DNA双链断裂标志蛋白)和GATA4免疫组化染色。同时收集人健康及炎症牙髓进行γ-H2A.X和GATA4免疫组化染色。人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)原代培养,1Ong/ml LPS连续刺激牙髓细胞6次建立DNA双链断裂细胞模型,通过western blot,RT-qPCR,免疫荧光检测γ-H2A.X、GATA4、细胞内NF-κB的表达及分布的变化。利用咖啡因预处理细胞18h抑制细胞DNA双链断裂或转染GATA4siRNA,检测γ-H2A.X、GATA4以及NF-κB的表达及分布以及炎症因子的表达。结果:免疫组化染色显示,γ-H2A.X和GATA4阳性细胞数在大鼠炎症诱导后第4天,6天,8天以及人炎症的牙髓组织中显著增加(P<0.05)。1Ong/mlLPS连续刺激hDPCs后,γ-H2A.X、GATA4的表达量以及NF-κB信号通路转录因子p65的核内聚集显著增加(P<0.05)。在LPS刺激下,siRNA组与对照组相比γ-H2A.X的表达量无明显变化,但是p65的核内聚集以及炎症因子的表达,包括TNF-α,IL-1β及IL-6显著降低(P<0.05)。咖啡因预处理后的牙髓细胞,γ-H2A.X、GATA4的表达量,p65的核内聚集以及炎症因子的表达显著降低(P<0.05)。结论:LPS刺激可导致hDPCs的DSBs。GATA4受到DSBs的正调节并且其表达与hDPCs的炎症反应成正相关。研究提示GATA4在LPS诱导的DSBs、以及NF-κB信号通路的活化过程中可能起关键调节作用。第二部分:DNA双链断裂修复蛋白Rad54b在腭发育及腭裂形成中的作用目的:探究DNA双链断裂修复蛋白Rad54b在腭发育中的作用以及DNA双链断裂对腭发育的影响,进一步扩展对腭裂发病机制的理解。材料与方法:利用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)和四氯二苯并-p-二恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)构建小鼠腭裂模型,收集正常及腭裂胎鼠的头部。分别对E13.5,E14.5,E15.5,E16.5正常及腭裂的胎鼠腭板进行γ-H2A.X和Rad54b免疫组化染色。小鼠腭板间充质细胞(mouse embryonic palatal mesenchymal cells,MEPMs)原代培养,转染 Rad54bsiRNA 或过表达腺病毒,流式细胞实验检测转染后细胞的凋亡及周期,CCK8检测细胞活性。Western blotting检测DNA双链断裂诱导剂依托泊苷(etoposide,ETO)加入转染后的MEPMs中γ-H2A.X的表达情况。RT-qPCR检测Rad54b的表达改变后DNA损伤修复相关基因(Chk1、Chk2、Rad51、Xrcc4)及腭发育相关基因(Msx1、Tgfβ3、Wnt5a、Egfr 的表达。结果:免疫组化染色显示,Rad54b表达于鼠胚腭板间充质,在E16.5时表达最高(P<0.001),并且在 E14.5-16.5 RA 组与 TCDD 组显著减少(P<0.05)。γ-H2A.X在E13.5-16.5对照组腭板间充质中表达量较低,而在RA组与TCDD组的表达量显著增加(P<0.05)。细胞周期检测结果显示,降低Rad54b的表达量,出现S期阻滞细胞增多(P<0.05)。细胞凋亡检测结果显示,增加或者降低Rad54b的表达量腭板间充质细胞的凋亡均增加(P<0.05)。CCK8结果显示,过表达及降低Rad54b均抑制细胞的增殖(P<0.05)。ETO刺激转染Rad54bsiRNA的MEPMs后,γ-H2A.X的表达量增加(P<0.05)。降低Rad54b使Chk1、Chk2、Xrcc4转录水平明显增高而过表达Rad54b后表达明显降低(P<0.05)。对于腭裂相关因子来说,降低Rad54b使Msx1、Tgfβ3、Wnt5a、Egfr的转录水平降低而过表达Rad54b结果出现明显反转(p<0.05)。结论:Rad54b通过影响细胞周期、增殖、凋亡在内的多个生物途径及DNA损伤修复及腭发育相关因子等来调节腭发育;Rad54b的缺失增加MEPMs对DSBs诱导剂的敏感性。研究提示Rad54b在环境诱发的腭裂过程中可能起关键调控作用。