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前言创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder, PTSD)是指在强烈的精神创伤后发生的心理、生理的应激反应所表现出的一系列临床综合症,是应激精神疾病中最为典型的一种。其核心症状可以简述为闯入性再体验、警觉性增高及反应麻木。随着战争、社会暴力、重大交通事故和自然灾害等意外事件的逐渐增多,PTSD发生率也愈加增高。现今,PTSD以其发病率高、病程长、难以治愈等特点,严重影响人们身心健康而备受关注。国内外对PTSD进行了大量研究,但其确切的发病机制尚未完全阐明。研究表明,HPA轴负反馈增强是PTSD的神经内分泌一个特征。神经递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)及其受体在HPA轴负反馈调节中起重要作用。5-羟色胺1A受体在情绪和精神调节中起重要作用。但其在PTSD中的作用目前研究不一。ERK1／2在包括神经元在内的许多细胞中均起重要作用,但目前对SPS时脑内神经元中ERK分子磷酸化的研究还只是刚刚起步。单一连续刺激(single prolonged stress, SPS)是PTSD动物模型的理想方法,该方法已经被国际所认同。本研究采用SPS方法建立PTSD大鼠模型,测定大鼠行为学改变和血清皮质醇浓度,验证PTSD模型的准确性。为探讨5-HT1A受体对GR和CRF的影响,我们利用5-HT 1A特异性阻断剂作用于SPS大鼠,观察大鼠海马GR和下丘脑CRF的变化。并观察SPS大鼠1nPFC中磷酸化的ERK1／2和c-fos的变化,探讨ERK通路抑制剂PD98059的作用。为揭示PTSD的发病机制提供实验依据。实验方法1、PTSD大鼠行为学改变将Wistar大鼠随机分为对照组和模型组。采用SPS方法建立PTSD模型。采用旷场(open-field, OF)实验、高架十字迷宫(elevated plus maze, EPM)实验、Morris水迷宫(Morris water mace, MWM)实验进行行为学测定,并测定大鼠的恐惧记忆的行为(僵立行为测定),采用化学发光法检测大鼠血清皮质醇浓度。2、PTSD大鼠5-HT1A受体活性与海马GR和下丘脑CRF表达的关系大鼠分为四组：(1)正常对照组(normal group),大鼠既不给予SPS处理,也不给予药物干预；(2)假手术组(sham group),实验动物不给予SPS处理,但给予等体积的溶剂；(3)模型组(SPS group),实验动物给予SPS处理,处理前给予等体积溶剂；(4)阻断组(blockade group),实验动物给予SPS处理和5-HT1A受体拮抗剂WAY100635。胶体金免疫电镜观察5-HT1A在海马和下丘脑神经元内的分布。免疫组织化学方法分析海马GR和下丘脑CRF表达。Westernblotting分析海马GR表达。RT-PCR分析GR mRNA和CRF mRNA变化。3、PTSD大鼠前额皮质磷酸化细胞外信号转导激酶的变化大鼠被随机分为三组：对照组、SPS组和PD98059+SPS组。SPS组和PD98059+SPS组大鼠给予SPS,并在SPS前30min分别双侧注入生理盐水和PD98059,对照组大鼠给予等体积生理盐水。用SABC法进行mPFC部位的pERK1／2的免疫组织化学染色,将染色后的切片经自动图像分析系统进行半定量分析。Western blotting分析mPFC部位的pERK1/2。RT-PCR分析c-fos mRNA表达结果一、PTSD大鼠行为学改变1、OF实验结果两组大鼠在旷场箱内主要在箱壁区域活动,其运动符合啮齿类动物的趋触性(thigmotaxis)的自然属性,即啮齿类动物趋向于沿壁活动。模型组大鼠中央格停留时间和直立次数显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),其余指标两组之间差异没有统计学意义(P>0.05)2、EMP实验结果EMP结果表明,大鼠活动符合大鼠趋暗的自然属性,即大鼠趋向于在光线暗处活动,大鼠在闭臂内活动时间和路程显著多于开臂。随着大鼠对环境的逐渐适应,大鼠向开臂内的探究行为逐渐增多。模型组大鼠在开臂内停留时间所占总臂内停留时间比显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。模型组大鼠进入开臂次数占总进臂次数的百分比显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。3、MWM实验结果模型组大鼠平均逃避潜伏期显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。4、僵立行为测定结果模型组大鼠再次放入强迫游泳玻璃缸中(重新面临恐惧情景时)后,大鼠表现为明显的僵立行为。对照组大鼠重新面临恐惧情景时,行为模式与模型组显然不同,表现为自由运动,出现探究、理毛等行为。对照组僵立行为百分比显著低于模型组,两组之间差异有统计学意义(P<0.01)5、血清皮质酮浓度模型组大鼠血清皮质酮浓度显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。二、PTSD大鼠5-HTlA受体活性与海马GR受体和下丘脑CRF表达的关系1、GR和CRF免疫组化分析结果GR的阳性细胞主要分布于海马的CA1区。正常对照组和假手术组之间GR表达没有明显差异。与正常对照组和假手术组相比较,模型组GR表达增高,阳性细胞明显增多(P<0.01),而阻断组阳性细胞数量则比SPS组减少(P<0.05),但仍高于正常对照组和假手术组(P<0.01)。正常对照组和假手术组之间下丘脑CRF表达没有明显差异,模型组CRF表达明显高于正常对照组和假手术组(P＜0.01),而阻断组阳性细胞数量则比SPS组减少(P<0.05)。2、Western blotting分析海马GR表达正常对照组和假手术组均有一定表达,模型组表达明显高于正常对照组和假手术组(P<0.01),阻断组GR表达低于SPS组(P<0.01)。3、RT-PCR分析海马GR mRNA和下丘脑CRF mRNA表达正常对照组和假手术组GR和CRFmRNA表达没有区别,但模型组二者表达显著增高(P<0.01),这种增高可以被WAY100635阻断(P<0.05)三、PTSD大鼠前额皮质磷酸化细胞外信号转导激酶的变化1、pERK1／2免疫组化染色pERK1／2蛋白定位在胞浆,阳性细胞显示棕黄色。对照组阳性细胞的OD值比较小,SPS组大鼠明显增高(P<0.01),PD98059+SPS组大鼠阳性细胞OD值明显比SPS组小(P<0.01)。2、pERK1/2 Western blotting分析SPS组大鼠pERK1/2相对表达明显增高(P<0.01),PD98059+SPS组大鼠pERK1/2比SPS组表达弱(P<0.01)。结果与免疫组化结果相一致。3、RT-PCR分析结果正常大鼠c-fos mRNA有低量表达。SPS大鼠表达增高,注入PD98059后,mPFC c-fos表达减弱(P<0.01)结论1、SPS能使大鼠具有PTSD症状。2、5-HT1A受体活性与海马GR、下丘脑CRF有关。5-HT1A受体活性可能促进海马GR表达,促进下丘脑CRF合成。3、SPS促使大鼠前额皮质ERK磷酸化增高,ERK活性与c-fos表达有关。