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第一节氧糖剥夺/恢复对A549肺泡上皮细胞焦亡的影响目的:体外循环（cardiopulmonary bypass,CPB）所造成的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是大型心脏外科手术最重要的并发症,其死亡率高,预后差。缺血再灌注是CPB中诱发急性肺损伤的重要的原因。细胞焦亡是一种依赖于炎性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）程序性死亡方式,伴随着炎症反应是细胞焦亡的显著特征,该过程与体外循环肺组织高水平炎症因子聚集有相似性。有研究表明,模拟体外循环缺血-再灌注过程可诱发鼠肺组织细胞焦亡而导致肺损伤发生[1]。因此体外循环中肺组织缺血-再灌注后细胞是否发生焦亡有待进一步研究,本研究通过建立A549肺泡上皮细胞氧糖剥夺/恢复（Oxygen-glucose Deprivation/Recovery,OGD/R）模型,检测细胞焦亡相关指标,观察OGD/R对A549肺泡上皮细胞焦亡相关指标水平的影响,为进一步探讨体外循环相关肺损伤发生机制提供参考。方法:（1）培养A549肺泡上皮细胞,进行OGD/R（6h/6h）造模,采用实时定量PCR（quantity real-time reverse transcription PCR,RT-q PCR）法和Western-blot法检测焦亡相关基因Caspase1、ASC、NLRP3、GSDMD的m RNA转录和蛋白质表达水平;（2）使用Caspase1特异性拮抗剂VX-765（50μM）预处理A549肺泡上皮细胞3小时后进行OGD/R（6h/6h）造模,检测Caspase1、焦亡效应蛋白GSDMD、培养上清中IL-1β、IL-18表达水平以及细胞存活率的变化。结果:（1）与对照组相比,OGD/R后A549肺泡上皮细胞Caspase1活性增高,焦亡相关基因Caspase1、ASC、NLRP3、GSDMD的m RNA和蛋白表达量均上调;（2）采用Caspase1特异性拮抗剂VX-765预处理3h后,细胞焦亡相关蛋白Caspase1、GSDMD蛋白表达量较OGD/R组明显减少,细胞培养上清液中焦亡标志产物细胞因子IL-1β、IL-18水平较OGD/R组也显著下降,细胞存活率较OGD/R组得到明显恢复。在OGD/R模型中,A549肺泡上皮细胞焦亡相关m RNA和蛋白表达水平明显升高,使用焦亡相关抑制剂VX-765预处理后A549肺泡上皮细胞焦亡相关蛋白和焦亡标志性产物均降低,减轻A549肺泡上皮细胞OGD/R损伤。结论:氧糖剥夺/恢复可诱导A549肺泡上皮细胞发生焦亡,抑制细胞焦亡的发生对氧糖剥夺/恢复细胞模型具有保护作用。第二节氧化应激在氧糖剥夺/恢复致A549肺泡上皮细胞焦亡中的作用目的:我们前面的实验提示氧糖剥夺/恢复可诱导A549肺泡上皮细胞发生焦亡,抑制细胞焦亡的发生对氧糖剥夺/恢复细胞模型具有保护作用。但OGD/R条件下,A549肺泡上皮细胞发生焦亡的具体机制有待进一步研究。有研究表明,氧化应激重要指标产物ROS是介导脑,心脏,肾脏和睾丸缺血/再灌注损伤中NLRP3炎性小体激活[2],在本研究中OGD/R引起的A549肺泡上皮细胞焦亡是否也由氧化应激ROS激活尚不确定。本部分研究通过建立A549肺泡上皮细胞氧糖剥夺/恢复模型,检测OGD/R对A549肺泡上皮细胞内氧化应激的影响情况;观察抗氧化剂乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）对A549肺泡上皮细胞氧化应激水平和细胞焦亡的影响,进一步为探讨体外循环相关肺损伤发生机制提供参考。方法:实验分组分为（1）Control组:A549肺泡上皮细胞不做任何处理,仅在平行时间点进行更换完全培养基操作,不实施氧糖剥夺/恢复等处理;（2）OGD/R组:A549肺泡上皮细胞进行氧糖剥夺6h,恢复6h处理;（3）OGD/R+NAC组:使用抗氧化剂NAC（10m M）预处理A549肺泡上皮细胞1小时后进行OGD/R造模。采用MTT试剂盒检测A549肺泡上皮细胞存活率变化,LDH试剂盒检测细胞膜通透性变化;流式细胞术检测A549肺泡上皮细胞内活性氧含量的表达变化;采用MDA、SOD、GSH试剂盒检测A549肺泡上皮细胞氧化应激变化;采用RT-q PCR法检测A549肺泡上皮细胞焦亡相关基因Caspase1、ASC、NLRP3、GSDMD的m RNA转录水平,Western-blot法检测对应的蛋白表达水平,ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达水平。结果:与Control组相比,OGD/R组A549肺泡上皮细胞存活率明显下降,细胞膜损伤程度加重;氧化应激产物ROS和MDA水平升高,同时抗氧化应激产物SOD和GSH水平降低;焦亡相关Caspase1、ASC、NLRP3、GSDMD的转录及翻译水平升高,上清液中细胞因子IL-1β、IL-18含量升高,提示在OGD/R模型中,A549肺泡上皮细胞损伤严重,细胞氧化应激表达升高,细胞焦亡相关m RNA和蛋白表达水平升高;与OGD/R组相比,OGD/R+NAC组细胞存活率提高,细胞膜损伤减少,细胞内ROS和MDA表达减少,SOD和GSH表达水平升高,焦亡相关基因Caspase1、ASC、NLRP3、GSDMD的m RNA、蛋白表达水平以及细胞因子IL-1β、IL-18表达水平均显著下调,提示使用抗氧化剂NAC有效缓解A549肺泡上皮细胞氧糖剥夺损伤,有效抑制A549肺泡上皮细胞氧化应激,降低细胞焦亡相关m RNA,蛋白和细胞焦亡效应因子表达。结论:在OGD/R模型中,A549肺泡上皮细胞活力下降,氧化应激损伤,NAC减轻细胞氧化应激损伤,降低A549肺泡上皮细胞焦亡效应产物。氧糖剥夺/恢复可诱导A549肺泡上皮细胞发生焦亡和氧化应激损伤,NAC通过抑制细胞氧化应激和焦亡,有效地保护细胞氧糖剥夺/恢复模型。