研究背景卵巢癌是女性生殖器系统常见的恶性肿瘤，发病率位于女性生殖系统恶性肿瘤第三位，但死亡率却居第一位[1,2]。由于卵巢癌发病隐匿，且缺乏有效的早期诊断措施，大多数患者首次确诊时已到中晚期。加之卵巢癌易出现化疗耐药及复发转移，尽管手术+综合化疗的治疗方法已经日趋成熟，但是患者预后差，五年生存率仍然较低[3]。因此，更好的研究卵巢癌发生发展及细胞耐药的分子机制，包括寻找与其密切相关的靶基因，对卵巢癌的早期诊断及有效治疗有着十分重要的临床价值。APE1/Ref-1（脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子）是近年来在肿瘤研究方面受到较多关注的一个基因。APE1/Ref-1是一种在细胞生命过程中扮演重要角色的多功能蛋白[4]。它不仅作为碱基切除修复途径中重要限速酶参与DNA修复过程，而且通过调节转录因子的氧化还原活性调控基因转录。另外，APE1/Ref-1与细胞凋亡、氧化信号传递及细胞周期的调控密切关联。现有研究结果表明，APE1/Ref-1在多种正常组织中广泛表达，在宫颈癌、结肠癌、胶质瘤、小细胞肺癌等肿瘤组织中表达升高或者亚定位改变。APE1/Ref-1是肿瘤及其相应正常组织间的差异表达基因，因此推测该基因与肿瘤发生发展相关，可能是潜在的癌基因。另一方面，鉴于APE1在DNA修复及细胞凋亡过程中的重要作用，我们推测APE1有可能参与了肿瘤细胞的化疗耐受，很有可能成为潜在的肿瘤治疗靶点。研究目的1.从组织水平研究APE1/Ref-1的表达与卵巢癌临床病理特征、血管生成及细胞增殖方面的关系，揭示其在卵巢癌发生、演进、血管生成中的功能。2.从细胞水平研究APE1/Ref-1对卵巢癌细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响，进一步揭示APE1/Ref-1在卵巢癌发生、演进中的作用及分子机制；为将来以APE1/Ref-1为靶点的卵巢癌基因治疗提供理论依据。3.从细胞水平研究PE1/Ref-1对卵巢癌顺铂耐药的影响，并初步探讨可能机制。为下一步以APE1/Ref-1为靶点逆转卵巢癌耐药的研究奠定基础。研究内容1. APE1/Ref-1表达与卵巢癌临床病理学特征、血管生成以及细胞增殖间的关系a)运用免疫组织化学技术检测APE1/Ref-1在65例卵巢癌石蜡标本组织中的表达、分析其与临床病理因素间的关系。运用Western Blot及定量PCR技术检测36例卵巢癌新鲜标本中APE1/Ref-1的表达。b)运用免疫组织化学技术检测APE1/Ref-1、PCNA、CD34在65例卵巢癌石蜡标本组织中的表达、分析APE1/Ref-1与增殖指数及血管形成间的关系。2. APE1/Ref-1对卵巢癌细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响a)运用Western blot及半定量PCR法检测五株卵巢癌细胞中APE1/Ref-1的表达；运用免疫荧光法检测HO-8910细胞中APE1/Ref-1蛋白的亚细胞定位。b)运用脂质体转染法将带有绿色荧光蛋白的APE1/Ref-1全长质粒转染卵巢癌HO-8910细胞，荧光显微镜下观察瞬转效率。c) G418筛选稳定转染APE1/Ref-1全长质粒及空载体的HO-8910细胞株。荧光显微镜、Western blot及半定量PCR检测靶基因的表达。d)运用MTT、平板克隆形成实验及FCM法检测APE1/Ref-1对HO-8910细胞增殖能力的影响。运用粘附实验、划痕实验及侵袭实验检测APE1/Ref-1对HO-8910细胞粘附、迁移及侵袭能力的影响。e) Western blot法检测转染前后AKt、p-AKt、Cyclin D1、MMP2及E-cadherin蛋白的表达。3. APE1/Ref-1对卵巢癌顺铂耐药的影响及可能机制a)运用MTT法及FCM法检测顺铂作用后，APE1/Ref-1对HO-8910细胞增殖及凋亡的影响。b) Western blot法检测顺铂诱导HO-8910细胞凋亡过程中Caspase4、8、9蛋白的活化情况。c) FCM法、Western blot法检测APE1/Ref-1对HO-8910细胞线粒体凋亡通路的影响。运用针对性试剂盒检测线粒体膜电位的变化及细胞内ATP水平变化，Western blot法检测线粒体凋亡通路蛋白细胞色素C、Bcl-2、Bax及cleaved caspase3蛋白的表达情况。研究结果1. APE1/Ref-1表达与卵巢癌临床病理学特征、血管生成以及细胞增殖间的关系a)在65例卵巢癌组织中，58例（89.23%）呈APE1阳性表达，7例（10.77%）呈APE1阴性表达；45例(69.23%)中APE1蛋白呈高表达（III+IV），20例(30.77%)呈低表达或不表达（I+II）。表达形式多为浆表达或者核浆共表达，单纯的核表达较少见。b)在卵巢癌组织中，APE1蛋白表达水平与年龄、家族史、肿瘤大小、病理分型及腹水无关(P>0.05)；与分化程度、FIGO分期及淋巴结转移有关(P <0.05)：高分化肿瘤APE1蛋白表达水平低于中低分化肿瘤；FIGO分期中，中晚期卵巢癌中APE1蛋白表达水平显著高于早期卵巢癌；有淋巴结转移的卵巢癌中APE1蛋白表达水平也高于无淋巴结转移的卵巢癌。c)在65例卵巢癌标本中有39例（60%）呈现PCNA高表达（>40%），阳性率从6.9-95.6%不等。表达形式为核表达。在APE1蛋白高表达（III+IV）的卵巢癌组织中PCNA指数为53.5±2.3，而在APE1蛋白低表达（I+II）组中仅为18.6±3.0，差异具有统计学意义(P <0.05)。在APE1蛋白阳性表达的卵巢癌组织中PCNA指数为40.3±4.1，而在APE1蛋白阴性表达组中仅为12.1±2.6，差异具有统计学意义(P <0.05)。d)在APE1蛋白高表达（III+IV）的卵巢癌组织中MVD为50.7±6.5，而在APE1蛋白低表达（I+II）组中仅为23.6±3.0，差异具有统计学意义(P <0.05)。在APE1蛋白阳性表达的卵巢癌组织中MVD为39.3±4.1，而在APE1蛋白阴性表达组中仅为20.1±3.5.，差异具有统计学意义(P <0.05)。e)36例卵巢癌临床标本Western Blot检测结果：随着分化程度升高APE1蛋白表达水平降低；随着FIGO分期增高，APE1蛋白表达水平增高。有淋巴结转移的组APE1蛋白的表达含量高于无淋巴结转移组。该结果与免疫组化结果基本一致。f)36例卵巢癌临床标本定量PCR检测结果：APE1与卵巢癌组织分化、FIGO分级及淋巴结转移有关(P <0.05）；而与年龄、家族史、肿瘤大小、病理分型及有无腹水无关联(P>0.05)。该实验结果与免疫组化及Western Blot的结果基本一致。2. APE1/Ref-1对卵巢癌细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响a) Western blot及半定量PCR方法对五株卵巢癌细胞检测结果：APE1蛋白在五株细胞中均有表达。表达含量在SKOV3、CP70、A2780、8910PM、 HO-8910呈递减趋势。半定量PCR检测结果与Western-Blot检测结果基本一致。b)免疫荧光检测结果：卵巢癌HO-8910细胞系中，几乎所有的细胞均为核浆共表达。c) HO-8910细胞转染APE1全长质粒48小时后，荧光显微镜下可见：细胞变圆，部分细胞散发强弱不一绿色荧光，初步判该质粒断瞬时转染效率为50-60%。G418筛选9天，HO-8910组细胞全部死亡，APE1转染组及空载体组大部分细胞死亡，少数有抗性细胞存活。继续筛选，两组可见抗性克隆形成；荧光显微镜下判断稳转效率约为95%。d) Western blot及半定量PCR检测结果：正常HO-8910细胞及空载体组APE1mRNA表达水平较低，而APE1转染组细胞APE1mRNA表达水平显著增高。Western blot结果与半定量PCR结果基本一致。e)生长曲线结果：APE1质粒转染组细胞与空载体组和HO-8910组细胞相比，生长曲线上升快，而空载体组与HO-8910组细胞生长特性基本一致。克隆计数结果：转染APE1质粒组细胞克隆数较空载体组及HO-8910组明显增高（P <0.05）。三组克隆形成率分别为：40%、38%、61%。流式法检测细胞周期结果：与HO-8910组及空载体组细胞相比，APE1质粒转染组G1期细胞比例减少，而G2+S期细胞比例增大。转染组增殖指数（PI）与HO-8910组和空载体组相比分别升高了12.1%，10.9%。f) MTT比色法检测A490nm各组细胞光吸收值，评价粘附能力，计算粘附率。结果：APE1转染组细胞OD值高于HO-8910组及空载体组，APE1转染组细胞对细胞外基质（Matrigel）的粘附能力显著高于其他两组（P <0.05）。划痕实验结果：HO-8910组细胞、空载体组及APE1转染组24小时迁移细胞个数分别为20.7±3.16、19.6±2.21、21.3±3.51，差异不具有显著性(P>0.05)。侵袭小室结果：空载体组与HO-8910组的穿膜细胞数相当，APE1质粒转染组穿过膜的细胞个数明显高于HO-8910组细胞及空载体组细胞(P <0.05)。g) Western Blot检测相关的蛋白结果：HO-8910组与空载体组磷酸化AKt及Cyclin D1蛋白表达量基本一致，APE1转染组细胞中磷酸化AKt及Cyclin D1蛋白表达较HO-8910组及空载体组显著升高，而三组总的AKt蛋白表达量没有改变。HO-8910组与空载体组MMP2及E-cadherin蛋白表达量基本一致，APE1转染组细胞中MMP2及E-cadherin蛋白表达量较HO-8910组及空载体组显著升高。3. APE1/Ref-1对卵巢癌顺铂耐药的影响及可能机制a) MTT结果：在相同浓度的顺铂作用下，HO-8910组和空载体组细胞抑制率无显著差异(P>0.05)。转染组细胞抑制率明显低于空载体组(P <0.05)。IC50结果：HO-8910组IC50值为22.12μM，,空载体组IC50值为19.84μM，转染组升高为29.86μM。b)流式检测凋亡结果：顺铂作用后，HO-8910细胞的凋亡率从4.5±0.6%上升到了74.6±8.1%。说明顺铂对HO-8910细胞的杀伤作用显著。空载体+DDP组与HO-8910+DDP组细胞凋亡率无显著变化(P>0.05)。但是在APE1质粒转染组，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），仅为63.0±7.1%。与空载体+DDP组相比，APE1质粒转染+DDP组细胞凋亡率下降了13.1%。c) Western Blot法检测三种蛋白的剪切激活情况（即检测cleavedcaspase-4、8、9三种蛋白表达水平的变化），结果：顺铂作用12小时出现明显的cleaved caspase-4及cleaved caspase-9的蛋白表达，而cleaved caspase-8蛋白无明显表达。说明顺铂作用12小时明显诱导了Caspase-4和Caspase-9的剪切激活，而并没有激活Caspase-8。d)线粒体膜电位及细胞内ATP结果：30μM的顺铂作用于H0-8910组、空载体组及转染组细胞24小时后，较未加药处理的H0-8910细胞，三组细胞荧光强度分别降低了31%。33%，18%，其中顺铂处理后转染组细胞荧光强度较空载体组升高了15%。加药处理后三组细胞内ATP水平均降低，其中顺铂处理后转染组细胞ATP水平较空载体组显著升高8.56±1.73vs4.64±1.03nmol/mg(P <0.05)。e) Western Blot法检测顺铂作用后三组细胞线粒体及胞浆中细胞色素C的表达情况，结果：HO-8910组、空载体组线粒体中细胞色素C的表达量基本一致，而转染组线粒体中细胞色素C的表达量较上述两组显著升高；HO-8910组、空载体组线胞浆中细胞色素C的表达量基本一致，而转染组胞浆中细胞色素C的表达量较上述两组显著降低。f)用Western Blot法检测顺铂作用后三组细胞Bcl-2、Bax及的表达及caspase3的活化情况，结果：HO-8910组及空载体组Bcl-2及Bax表达水平无显著差异，APE1转染组中细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2较前两组明显升高，促凋亡蛋白Bax表达较前两组明显降低。三组细胞均检测到caspase3的激活形式cleaved caspase3的表达，HO-8910组及空载体组cleaved caspase3表达水平无显著差异，但APE1转染组cleaved caspase3表达水平明显高于另外两组。研究结论1. APE1的表达与卵巢癌分化程度、FIGO分期及淋巴结转移有关；与PCNA指数及MVD相关。APE1在卵巢癌的发生发展、血管生成及侵袭转移的过程中扮演着重要角色。2.上调APE1表达能促进人卵巢癌HO-8910细胞体外增殖能力，该作用可能是通过激活PI3K/AKt通路发挥的，APE1有可能是PI3K/AKt信号通路潜在的调节因子。3.上调APE1表达能促进人卵巢癌HO-8910细胞体外粘附、侵袭能力，该作用是通过上调MMP-2及E-cadherin的表达而发挥的。4.上调APE1表达能够提高HO-8910细胞对顺铂的耐受性，可以抑制顺铂作用下HO-8910细胞凋亡的发生。APE1在卵巢癌顺铂耐药的过程中起着正性作用。5.顺铂诱导H0-8910细胞凋亡激活线粒体及内质网凋亡通路，而并没有激活死亡受体凋亡通路。6. APE1影响卵巢癌铂类耐药可能是通过影响线粒体凋亡途径实现的。