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背景与目的大气颗粒物（particulate matter,PM）中空气动力学直径小于2.5μm的细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)是造成全球空气污染的主要原因,对人类健康构成巨大威胁。环境毒理学和流行病学研究表明,PM2.5暴露能对呼吸系统、心血管系统、泌尿系统、消化系统、生殖系统甚至神经系统造成不良影响,从而导致肺部、心脏、肝脏、肾脏、脾脏等多个器官损伤。PM2.5对健康损害的机制常涉及免疫毒性、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡和DNA损伤。PM2.5暴露可对动物、细胞甚至人类产生严重的基因毒性效应,DNA损伤被认为是PM2.5介导基因毒性的关键事件。DNA损伤是更为复杂的反应,更容易导致基因组的不稳定性和不完整性,从而造成细胞衰老、细胞死亡甚至癌变。PM2.5暴露会导致小鼠多器官氧化性DNA损伤,但PM2.5暴露后各器官的病理损伤和机制并不一致,对于PM2.5诱导多器官DNA损伤的机制还有待更全面的研究。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）的一种,不具有3’和5’端,在哺乳动物中具有共价闭环结构,且丰富多样和高度保守,并表现出组织/发育阶段特异性的表达。根据环状RNA在细胞中的位置,它可以执行不同的功能,细胞质中的环状RNA可以通过结合微小RNA（micro RNA,mi RNA）和RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）发挥生物学功能,而细胞核中的circ RNA则参与基因转录、选择性剪接和染色质相互作用的调控。mi RNA和长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）可在环境化学物导致的DNA损伤中发挥重要作用。但在暴露于环境化学物后circ RNA调节DNA损伤的功能和机制尚不清楚。本研究探讨PM2.5暴露对雄性ICR小鼠的病理学改变、DNA损伤、DNA修复及circ RNA表达谱的影响,重点研究circ RNA在PM2.5暴露后的小鼠多器官DNA损伤的作用和机制。方法在PM2.5引起的DNA损伤中,主要选择了雄性ICR小鼠和RAW264.7细胞为研究对象。通过组织病理学检查、蛋白质免疫印迹及ELISA实验检测PM2.5引起的小鼠多器官损害和DNA损伤。通过CCK8试剂盒和LDH试剂盒检测PM2.5诱导的细胞毒性。通过蛋白质免疫印迹、碱性彗星实验和细胞免疫荧光实验检测PM2.5诱导的细胞DNA损伤程度。通过q RT-PCR和蛋白质免疫印迹探讨PM2.5对DNA修复通路的影响。通过对小鼠肺组织的circ RNA高通量测序,q RT-PCR挑选验证PM2.5引起差异表达的circ RNA。通过核质分离实验和去线性酶实验证实circ RNA特性。并通过设计合成circ RNA干扰序列和过表达载体,在RAW264.7细胞进行circ RNA干扰/过表达实验,探讨circ RNA在PM2.5诱导的DNA损伤和DNA修复的功能。通过皮尔森相关性分析,探讨circ RNA和DNA损伤及DNA修复的关联性。结果对小鼠多器官的组织病理学检查显示,PM2.5暴露能引起小鼠肺组织肺泡毛细血管充血、肺泡壁增厚、支气管周围有大量中性粒细胞浸润;PM2.5暴露能引起小鼠肾脏组织肾小球周围炎症细胞浸润增加及肾小管管腔上皮细胞脱落;PM2.5暴露能引起脾脏组织红白髓分界较模糊、红髓中可见较多髓外造血细胞和中性粒细胞。蛋白质免疫印迹实验表明PM2.5暴露促使小鼠肺部、肾脏和脾脏的组蛋白H2AX磷酸化（γ-H2AX）,表明PM2.5能引起小鼠肺部、肾脏、脾脏DNA损伤;ELISA实验表明PM2.5可促进分泌8-羟基脱氧鸟苷的水平,表明PM2.5诱导小鼠血液发生氧化性DNA损伤。CCK8实验表明PM2.5导致RAW264.7细胞活力下降,且呈剂量依赖性下降;而LDH释放实验表明PM2.5导致RAW264.7细胞的LDH活性增加,且呈剂量依赖性增加。蛋白质免疫印迹实验表明PM2.5促使RAW264.7细胞的γ-H2AX蛋白水平呈剂量依赖性增加趋势;彗星实验表明PM2.5能使RAW264.7细胞的Olive尾矩增加;细胞免疫荧光实验表明PM2.5可诱导的RAW264.7细胞γ-H2AX蛋白的焦点形成增加,这些表明PM2.5可诱导RAW264.7细胞DNA损伤。qRT-PCR实验表明PM2.5可使小鼠肺部、肾脏、脾脏和血液中的Lig4和Dclre1c的m RNA水平呈下降趋势,表明PM2.5能抑制非同源末端连接（non-homologous end-joining repair,NHEJ）修复通路;蛋白质免疫印迹实验表明PM2.5可使小鼠肺部、肾脏和脾脏中的Lig4和Dclre1c的蛋白水平呈下降趋势。q RT-PCR和蛋白质免疫印迹实验表明PM2.5诱导的RAW264.7细胞中Lig4和Dclre1c的m RNA水平和蛋白水平呈剂量依赖性下降趋势。通过小鼠肺组织circ RNA高通量测序,发现PM2.5使circ＿010009在小鼠肺部、脾脏、血液和RAW264.7细胞中呈现高表达趋势,但在小鼠肾脏中呈现低表达趋势。使用RNase R证明了circ＿010009的稳定性,表明circ＿010009对RNase R的过度消化具有抵抗力,而线性RNA被RNase R严重降解,这也表明circ＿010009能以稳定环状结构的形式存在。然后,我们通过核质分离实验发现circ＿010009主要定位在RAW264.7细胞的细胞质中。为研究circ＿010009对PM2.5诱导DNA损伤的作用,我们首先在RAW264.7细胞敲低circ＿010009的表达,发现和si-NC+PM2.5染毒组相比,si-circ＿010009+PM2.5组的γ-H2AX蛋白水平明显下降,表明干扰circ＿010009可减少DNA损伤。然后在RAW264.7细胞过表达circ＿010009,发现和mock+PM2.5染毒组相比,OE-circ＿010009+PM2.5组的γ-H2AX蛋白水平明显增加,表明过表达circ＿010009则加重DNA损伤。皮尔森相关性分析表明,circ＿010009和γ-H2AX蛋白水平在小鼠肺部和脾脏中呈正相关性,但在肾脏中呈现负相关性;血液中的circ＿010009和8-羟基脱氧鸟苷水平呈现正相关性。为了探讨circ＿010009对PM2.5诱导的NHEJ修复抑制的作用,我们在RAW264.7细胞敲低/过表达circ＿010009。发现和si-NC+PM2.5染毒组相比,si-circ＿010009+PM2.5组的Lig4和Dclre1c的m RNA和蛋白水平明显增加,表明干扰circ＿010009可以缓解PM2.5导致的NHEJ修复抑制。相反地,和mock+PM2.5染毒组相比,OE-circ＿010009+PM2.5组的Lig4和Dclre1c的m RNA和蛋白水平明显下降,表明过表达circ＿010009加重PM2.5导致的NHEJ修复抑制。皮尔森相关性分析表明,circ＿010009和Lig4或Dclre1c水平在小鼠肺部、脾脏和血液中呈负相关性,但在肾脏中呈现正相关性。结论1.PM2.5暴露可引起雄性ICR小鼠多器官病理学改变和DNA损伤。2.PM2.5暴露可引起RAW264.7细胞毒性和DNA损伤。3.PM2.5暴露可抑制雄性ICR小鼠多器官和RAW264.7细胞的NHEJ修复。4.PM2.5暴露致circ＿010009在雄性ICR小鼠多器官和RAW264.7细胞中高表达,且circ＿010009调控PM2.5诱导的DNA损伤。5.circ＿010009通过抑制NHEJ修复加重PM2.5诱导的DNA损伤,且和NHEJ修复相关基因在小鼠多器官和血液具有强相关性。