论文部分内容阅读
目的:小类泛素修饰蛋白或称小泛素相关修饰物(Small Ubiquitin-like Modifier Protein,SUMOs)家族是一类新近发现的泛素样分子物质,是一类结构与泛素蛋白家族类似但功能迥异的小分子蛋白,它们也参与蛋白质翻译后修饰过程,但是不参与靶蛋白的蛋白酶体降解,而是通过与靶蛋白中的特定赖氨酸残基共价连接来可逆性修饰靶蛋白,广泛参与靶蛋白的功能调节及定位过程。在与氧化应激相关疾病的发生发展过程中,SUMOs通过与靶蛋白(如转录因子与转录辅助因子)的共价结合发挥对损伤细胞的修复作用。脑缺血早期常诱导明显的氧化应激反应,因此我们推测在缺血性脑血管病发生后,特别是急性应激期可能存在大量SUMOs家族成员的活化,并可能通过与靶蛋白的共价结合提高缺血耐受而发挥特定的神经元保护作用。总体来说,增强的蛋白质SUMO化极可能代表细胞保护性反应。本研究的目的即通过体内、外(在体、离体)实验模型检测SUMOs家族成员在缺血性脑血管病发生后的活化情况、结合蛋白的亚细胞定位及其是否具有一定的神经保护功能,为未来神经保护性药物的研发提供理论及证据支持、可能的治疗靶点和方法借鉴。方法:1、原代分离培养新生24小时Sprague-Dawley(SD)乳鼠海马神经元细胞,应用免疫荧光方法鉴定神经元纯度;2、建立氧/糖剥夺(OGD)神经元模型,应用原位细胞凋亡方法检测细胞凋亡数量;3、应用Western Blot方法检测SUMO-1和SUMO-2/3的蛋白质表达水平,应用细胞免疫荧光双染方法检测SUMO-1和SUMO-2/3的蛋白定位变化;4、利用神经元特异性SUMOs基因敲除小鼠建立大脑中动脉梗死(MCAO)模型,比较SUMOs基因敲除MCAO小鼠和野生型MCAO小鼠的动物神经功能评分;5、解剖小鼠脑组织,切片后比较梗死体积。原位凋亡法(TUNEL)检测海马区神经元凋亡情况。结果:1、利用原代贴壁细胞培养法成功获得大鼠海马神经元细胞,经免疫荧光方法鉴定所培养细胞高表达神经元标记蛋白——神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白-2(MAP-2),不表达神经胶质细胞标记蛋白——胶质纤维酸性蛋白(GFAP),神经元纯度大于96%;2、原位细胞凋亡实验结果显示OGD神经元发生细胞凋亡的细胞数量明显多于正常对照细胞(P<0.01);3、Western Blot结果发现OGD神经元中SUMO-2/3的蛋白质表达水平明显上升(P<0.01),但SUMO-1的蛋白质表达水平无明显变化(P>0.05)。细胞免疫荧光实验结果显示OGD神经元中发生了SUMO-2/3蛋白由细胞浆向细胞核的移位现象(核聚集);4、MCAO动物模型实验结果显示神经元特异性SUMO-1~3基因敲除小鼠接受MCAO处理后,其动物神经功能评分在造模后6d、11d、16d均明显劣于接受MCAO处理的野生型小鼠(P<0.01);5、神经元特异性SUMO-1~3基因敲除小鼠在接受相同MCAO手术处理后脑梗死体积明显大于野生型小鼠(P<0.01);其海马神经元细胞凋亡百分率明显高于野生型小鼠(P<0.01)。结论:在缺血性脑血管病发生早期,小类泛素修饰蛋白家族成员中的SUMO-2/3即被快速活化,并通过其由细胞浆向细胞核的移位发挥潜在的神经元保护作用,而SUMO-1则几乎不参与该疾病病理生理过程。SUMOs的存在对于脑缺血后的神经功能恢复具有肯定的保护作用,是内源性神经保护途径的关键因子,也可以提高脑组织对于缺血的耐受性。外源性补充SUMO-2/3小分子蛋白或诱导SUMO-2/3表达的药物有望成为新的神经保护药物而被研发和推广应用。