[研究背景]浸润性乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,在全球范围占女性癌症的23%。乳腺癌发病率仍在逐年升高,严重危害世界女性健康。化学治疗是治疗乳腺癌的主要手段之一,但是癌细胞的对化疗药物的多药耐药(multidrug resistance, MDR)严重影响化疗药的有效性。多药耐药是指在药物诱导后,肿瘤对一系列结构、靶点和作用机制不同的药物均产生了耐药性。P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)是由多药耐药基因1(MDRl)编码,是最重要的药物转运蛋白,是恶性肿瘤原发性和继发性耐药的主要原因,与细胞内药物浓度及耐药程度密切相关。目前报道显示许多抗肿瘤药物,包括多柔比星、紫杉醇等均为P-糖蛋白的作用底物。MDR1基因在人体恶性肿瘤中广泛表达,约50%的乳腺癌的多药耐药与P-糖蛋白的过表达相关。即使在低表达的肿瘤,治疗后也可产生P-糖蛋白的高表达,恶性肿瘤化疗后P-糖蛋白表达率高达88%。多药耐药导致化疗失败、肿瘤转移、患者生存期缩短以及肿瘤治疗成本的显著增加。对于P－gp高表达的恶性肿瘤,可使用MDR1逆转剂,以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。目前经常应用化学合成的抑制剂以增加肿瘤细胞的敏感性,但是在达到有效浓度时也具有较大的毒性。这促使人们更深入地研究MDR1的表达调节机制。研究表明MDR1的表达主要由类固醇和异生素受体(steroid and xenobiotic receptor, SXR)的调节。SXR是一种细胞核受体(nuclear receptor, NR),核受体的转录调节作用需要和多种共激活因子协同完成。与相应配体结合后,经过一系列复杂的过程,核受体会募集几种不同的共激活因子到靶基因的启动子区,形成转录激活复合物。共激活因子有的通过蛋白质-蛋白质的相互作用行使功能,能够促进或抑制其它共激活因子或特定的转录元件的募集；有的可通过酶活性来催化相关蛋白的翻译后修饰。在核受体介导的转录调节中,翻译后修饰起着重要的作用,具有酶活性的共激活因子的翻译后修饰在配体触发的转录调控中是必不可少的。在SXR对MDR1的调控中,SXR与相应药物配体结合后,在p160蛋白家族介导下,激活定位于MDR1基因启动子的异生素反应元件(xenobiotic-response elements, XREs),启动MDR1的转录。在这个过程中,P160共激活因子家族直接与核受体结合,是募集其他共激活因子的重要支架。但是目前仍不清楚具体还有那些共激活因子参与了SXR对MDR1的转录激活过程,这尚需深入研究。精氨酸甲基化是一种近年发现的转录后修饰,由蛋白精氨酸甲基转移酶(protein argininemethyltransferase, PRMTs)家族催化。在哺乳动物体内,迄今共发现11个PRMTs家族成员；根据酶催化产物的结构,可将PRMTs分为Ⅰ型和Ⅱ型两大类。Ⅰ型PRMTs (PRMT1, PRMT4, PRMT3和PRMT6)形成非对称二甲基精氨酸,而Ⅱ型酶催化形成对称性二甲基精氨酸。PRMT4又称为共激活相关精氨酸甲基化转移酶1(coactivator-associated arginine methyltransferase1, CARM1),最初是在酵母双杂交筛选发现的,是p160共激活因子家族的结合蛋白。后来研究逐渐发现CARM1在细胞内具有多方面的功能,特别在控制细胞周期和生存方面。CARM1能够甲基化组蛋白和多种非组蛋白,是多种核受体转录激活的共激活因子,也可以共激活其它多种转录因子。目前关于CARM1在恶性肿瘤中的表达情况的研究并不多,已有报道CARM1在前列腺癌和大肠癌中高表达并且与预后差的指标有关。少数研究报道了CARM1在人乳腺癌组织的异常表达。但是目前的研究存在矛盾之处。El MessaoudiS检测了81例乳腺癌组织的CARM1mRNA表达水平,发现CARM1在组织学三级的乳腺癌中显著升高。但是也有研究表明在ER阳性和无淋巴结转移的乳腺癌中,CARM1的表达与肿瘤的组织学分级之间呈负相关性。还有研究报道CARM1过表达仅见于少数乳腺癌患者(27%)。上述研究提示CARM1是一个可能是影响乳腺癌进展和预后的重要因素。然而,这些研究只研究了少数病例或者只研究CARM1在乳腺癌特殊亚型中的表达。目前还不清楚CARM1表达与临床病理特征,分子分型和预后之间的关系。目前虽然已有研究证实CARM1是许多核受体的共激活因子,例如雌激素受体、雄激素受体、糖皮质激素受体和甲状腺激素受体等,但是还没有研究证实CARM1参与了核受体SXR对MDR1的转录激活过程。SXR对于MDR1的转录激活过程需要p160蛋白家族参与,而CARM1被证明是p160家族的转录辅激活因子,p160家族的三个成员都是CARM1的天然底物。综上所述,CARM1在p160参与的数种核受体转录激活中起着重要作用,极有可能参加了SXR对MDR1的调节。研究CARM1与SXR和MDR1的相关性,探讨其参与肿瘤多药耐药的调控机制,或为多药耐药逆转提供新的治疗靶点。本研究首先应用免疫组织化学染色的方法,检测了247未经治疗的原发性乳腺浸润性癌组织中CARM1、ER、PR、HER2、p53、Ki-67指数和MDR1/P-gp的表达情况。进而检测了乳腺癌敏感细胞株MCF-7和多药耐药细胞株MCF-7/ADM中的CARM1的表达,结果表明,在多药耐药细胞中,CARM1mRNA的水平和蛋白水平均显著高于敏感细胞,提示CARM1在MDR1介导的乳腺癌细胞的多药耐药的过程中可能具有潜在作用。因此,在本研究中设计并合成针对CARM1基因的双链干扰RNA序列(siRNA),将其定向插入到质粒载体中,经酶切和测序鉴定后,转染至乳腺癌耐药细胞株来沉默CARM1表达,以期下调MDR1/P-gp的表达,从而逆转MDR1介导的多药耐药；同时将含有CARM1全长DNA的质粒转染至敏感细胞株中,观察CARM1外源性过表达对MDR1/P-gp的表达和功能的影响；从而初步探讨CARM1参与调控MDR1的可能的机制。[研究方法]1.采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物法Streptavidin-Peroxidasecomplex method)检测247例未经治疗的原发性乳腺浸润性癌组织中CARM1、ER、PR、HER2、p53、Ki-67指数和MDR1的表达情况,并分析了CARM1的表达与乳腺癌临床病理特征、常用分子指标和分子亚型之间的关系,同时分析了CARM1与和MDR1之间的相关性。2.以本实验室培养的乳腺癌敏感细胞系MCF-7和多药耐药细胞系MCF-7/ADM为研究对象,用RT-PCR和Western Blot方法分别检测CARM1及MDR1/P-gp的mRNA和蛋白表达情况。3.设计并合成靶向CARM1基因的双链干扰RNA序列,以和作为阴性对照的非靶向干扰序列,将其定向插入到质粒载体pSUPER.neo+GFP中,构建稳定表达的质粒载体pSUPER-siCARM1和pSUPER-siNotargeto经过限制性内切酶切和测序鉴定,确保插入正确后,通过细菌培养大量扩增。4.哺乳动物表达质粒pSG5.HA-CARM1和pSG5.HA由Michael R. Stallcup教授(美国南加利福尼亚大学)惠赠.将CARM1全长DNA经限制性内切酶酶切后,插入到pEGFP-C1质粒中,得到重组质粒pEGFP-C1-CARM1。经过限制性内切酶切和测序鉴定,确保插入正确后,通过细菌培养大量扩增。5.分别转染CARM1干扰质粒载体和外源性过表达质粒至多药耐药细胞和敏感细胞中；经过48h培养,采用RT-PCR检测各实验组细胞中CARM1mRNA和MDR1mRNA的表达情况,应用Western blot检测CARM1蛋白和P-糖蛋白表达情况,应用MTT法检测各组细胞对阿霉素的半数细胞抑制浓度(IC50)和相对耐药指数(RR)的改变,评价CARM1基因沉默和外源性过表达后对乳腺癌细胞的多药耐药性的影响。[实验结果]1.免疫组化：CARM1染色可见于细胞核和细胞浆。与其周围良性上皮相比,腺癌的表达显著增高。CARM1过表达与以下指标显著相关：低发病年龄、较高的组织学分级、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)阴性、HER2和p53过表达、以及高Ki-67指数。在乳腺癌的分子亚型中,HER2亚型中CARM1表达率最高(69.6%),其次是luminal B亚型(59.6%)和TN亚型(57.1%),luminal A亚型的表达率最低(41.3%)。在乳腺癌组织中,MDR1/P-gp表达率为45.7%,CARM1的表达与MDR1/P-gp表达呈显著正相关。2.对本实验室培养的乳腺癌敏感细胞系和多药耐药细胞系的检测结果表明,在多药耐药细胞MCF-7/ADM中,CARM1的mRNA水平和蛋白水平均较敏感细胞MCF-7显著升高；MCF-7/ADM细胞中高表达MDR1/P-gp,而敏感株MCF-7几乎不表达。3.转染后48h,收集细胞,应用半定量RT-PCR检测转染pSUPER-siCARM1的耐药细胞中CARM1和MDR1mRNA的表达情况,结果显示：CARM1干扰组的CARM1及MDR1mRNA水平均较对照组(转染非靶向性siRNA)明显降低；Western blot同样显示,CARM1和MDR1/P-gp的蛋白表达水平在CARM1干扰组细胞中显著低于对照组细胞；MTT法检测癌细胞对阿霉素的耐受性,发现CARM1干扰组细胞对阿霉素的IC50明显降低,相对耐药指数显著下降,明显逆转了癌细胞的耐药性。4.转染48h后,应用半定量RT-PCR检测转染pEGFP-C1-CARM1的敏感细胞系MCF-7中CARM1和MDR1mRNA水平的表达情况,结果表明,外源性过表达CARM1组的CARM1mRNA和蛋白水平均较对照组均明显升高,但是MDR1/P-gp的mRNA和蛋白水平无显著性升高；MTT显示外源性过表达CARM1组对阿霉素的耐受性无明显变化。[结论]1.免疫组化结果表明,CARM1在乳腺癌组织中的表达较周围良性上皮细胞明显升高。定位于癌细胞核的CARM1过表达与低发病年龄、多发性或多中心性肿瘤、高组织学级别、雌激素和孕激素受体阴性、HER2过表达、p53过表达和高Ki-67指数有关。CARM1在不同的分子亚型之间表达水平不同,提示在不同分子亚型中,CARM1可能参与不同的机制调节肿瘤生长。2.在乳腺癌组织中,CARM1蛋白的表达与MDR1/P-gp的表达呈显著正相关。在乳腺癌细胞多药耐药细胞株中,CARM1与MDR1均呈高表达,提示CARM1与MDR1介导的获得性多药耐药之间具有相关性。3.在乳腺癌细胞多药耐药细胞株中,干扰CARM1能够抑制MDR1的表达,使得癌细胞的多药耐药性显著降低,从而逆转多药耐药,表明CARM1参与了MDR1/P-gp调节过程；4.在乳腺癌细胞敏感细胞株中,外源性过表达CARM1未引起MDR1/P-gp的表达和功能的改变,提示CARM1可能是核受体介导的MDR1/P-gp转录激活过程中的辅激活因子。5. CARM1可调控MDR1/P-gp介导的乳腺癌细胞多药耐药,可能是潜在的可预知乳腺癌化疗敏感性的指标,可能有助于个性化治疗,并为逆转多药耐药的提供新的靶点。