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DNA条形码是运用一段（或几段）标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA序列对物种进行快速、准确识别和鉴定的技术。CBOL提出陆地植物通用的核心条形码为rbcL+ matK，补充条形码为trnH-psbA或ITS。本研究对蕨类植物铁线蕨属进行了DNA条码筛选，发现matK引物通用性低、ITS为多拷贝，二者均不适宜作为该属植物的DNA条形码。本研究另筛选了4个单拷贝或低拷贝核基因（pgiC、gapCp、LEAFY和ITS2），但均未得到理想的PCR扩增率或干净的蜂图。根据最新文献又选取了3个单拷贝核基因(IBR3_2、DETl和SQD1_1)进行试验，其中IBR3_2基因的PCR扩增率接近100％，但测序成功率不理想，目前仅在鞭叶铁线蕨系进行了后续分析。鉴于有学者将trnL-F作为蕨类植物的推荐条形码，rps4-trnS为蕨类植物系统研究中普遍应用的片段，我们选择了rbcL、trnH-psbA、trnL-F和rps4-trnS在铁线蕨属29个种184个样本中进行了比较评价，对四个候选条形码的序列变异和NJ树结果与传统分类结果进行了比较讨论，并运用四个候选条形码对3个存疑物种进行了验证。研究结果显示4个片段各有其优缺点，rbcL虽然种间遗传变异距离最低，但有着最高的PCR扩增成功率、测序成功率和鉴定成功率(89.57％、89.73％和77.8％)。trnH-psbA扩增成功率(88.11％)仅次于rbcL，但测序成功率87.12％（排第3），鉴定成功率最低(65.38％)。 trnL-F在PCR扩增和测序方面表现最差(66.49％和82.93％)，鉴定成功率为72％（第2），但具最大种间种内遗传变异和种间变异率。rps4-trnS的PCR扩增成功率83.61％（排在4个片段的第3位），测序成功率仅低于rbcL(88.24％)，鉴定成功率(69.23％)低于rbcL和trnL-F。综合考虑引物通用性、序列质量和物种鉴定成功率，rbcL是铁线蕨属最佳条形码选择，另外3个条形码可根据研究目的和研究对象选择使用，trnL-F适用于种下单元的DNA条形码研究。 运用单拷贝核基因IBR3_2和4个质体片段的分析结果，结合形态-地理学，支持孟连铁线蕨是独立于半月形铁线蕨的一自然种。trnL-F的分析结果，结合形态-地理学，支持本属内白背铁线蕨变种长刺铁线蕨、陇南铁线蕨变种台湾高山铁线蕨和月芽铁线蕨变种鹤庆铁线蕨等3个变种的划分。4个质体片段的分析结果及形态-地理分析，支持仙霞铁线蕨和粤铁线蕨分别是北江铁线蕨和白垩铁线蕨的异名。DNA条形码在3个存疑物种中的应用结合形态特征表明，深山铁线蕨应处理为月芽铁线蕨的异名;支持肾盖铁线蕨降级为陇南铁线蕨变种;越南分布新记录种仙霞铁线蕨可能为白垩铁线蕨系的一新种。