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HIV潜伏是艾滋病治愈的主要障碍,高效HIV潜伏激活剂的发现是解决这一问题的关键途径。天然产物是HIV潜伏激活剂发现的一个重要源泉。黄芫花是山西省一味道地药材,传统可用于治疗传染性肝炎等疾病。前期本课题组从黄芫花中已分离获得结构新颖的瑞香烷型和惕各烷型二萜。因此,本论文拟对已获得的二萜进行HIV潜伏激活活性测试,筛选出高效的潜伏激活剂,并对其开展激活机制研究。本论文主要包括以下内容:1.采用J-Lat A2细胞和HeLa-NH2细胞,评价了黄芫花中的17个二萜化合物的潜伏HIV的激活活性。结果发现,3个二萜化合物pimelea factor P2、pimelea factor S7、Wikstroelide E在浓度为10 nM时呈现出极强的激活活性,在相同的激活倍数下,化合物Wikstroelide E的激活浓度仅为阳性药物prostratin的1/500。2.进一步采用HeLa-NH1、HeLa-NH2、J-Lat A2和J-Lat 2D10四种细胞株测试了不同浓度和不同处理时间下Wikstroelide E对潜伏HIV的激活作用。结果表明:Wikstroelide E对潜伏HIV的激活作用呈现浓度和时间依赖性,其最佳激活浓度为:5-20 nM,最佳激活处理时间为:24 h。3.通过转录组学和蛋白质组学方法评价了Wikstroelide E处理J-Lat A2细胞的基因和蛋白表达差异,并通过GO和KEGG分析,探索Wikstroelide E对J-Lat A2细胞中生物学过程的影响。转录组学结果发现,Wikstroelide E处理J-Lat A2细胞6 h后,细胞讯息传递、信号传导等细胞过程发生显著改变,特别是PI3K/AKT信号通路、NF-κB信号通路受到Wikstroelide E的调节。蛋白质组学结果发现,Wikstroelide E处理J-Lat A2细胞24 h后,细胞中的白介素的表达、PI3K-Akt信号通路等发生显著变化。进一步比较分析显著差异表达基因和蛋白,显示蛋白水平与转录水平的变化具有较好的一致性。根据转录组学和蛋白质组学的的KEGG富集分析发现,NF-κB信号通路是显著受到Wikstroelide E调节的信号通路之一。4.运用细胞生物学方法验证Wikstroelide E是否会通过影响NF-κB信号通路发挥激活潜伏HIV作用。首先采用免疫印迹法检测Wikstroelide E处理后,细胞内IκB-α的降解和p65蛋白的入核情况,结果表明,采用不同浓度和孵育时间的Wikstroelide E处理J-Lat A2细胞和HeLa-NH2细胞,提取总蛋白用WB检测,iκB-α蛋白水平显著下调;采用Wikstroelide E处理J-Lat A2细胞和HeLa-NH2细胞不同时间,提取核蛋白和胞浆蛋白用WB检测,0-60 min内,p65核内蛋白水平显著上调,胞内水平显著下调。进一步,采用NF-κB抑制剂:PDTC和BAY 11-7082分别与Wikstroelide E共处理,发现其抑制了Wikstroelide E对潜伏HIV的激活作用。5.运用DARTS技术初步探索了Wikstroelide E的作用靶点。通过筛选链霉蛋白酶E的浓度获得影响较大的蛋白条带,再结合LC/MS/MS分析获得差异蛋白。结果表明Wikstroelide E能够影响45个蛋白的蛋白酶解稳定性,其中18个蛋白的稳定性增加,27个蛋白的稳定性降低。然后,采用CETSA技术,结合WB检测结果发现发现Wikstroelide E能够结合PKC-α,提高其稳定性,表明PKC-α可能是Wikstroelide E作用靶点。