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背景和目的:炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种肠道慢性复发性炎性疾病,主要包括两种类型:溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。IBD病因尚不明确,目前普遍观点认为IBD是遗传因素、环境因素、免疫和肠道微生物共同作用的结果。近年来,固有免疫在IBD发病中的作用研究已成热点。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是固有免疫中识别微生物和损伤相关抗原的关键分子,在IBD发病及进展中扮演着重要的角色。TLR4是最早在哺乳动物中发现的TLRs家族成员,需与其辅助分子髓样分化蛋白-2(Myeloid differentiation protei-2,MD-2)形成二聚体发挥功能。TLR4/MD-2识别相应配体后启动下游髓样分化蛋白88(Myeloid differentiation protein 88,MyD88)依赖或MyD88非依赖信号通路。MyD88依赖通路主要活化NF-κB并最终导致促炎细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6的大量释放,触发并维持肠道炎症;MyD88非依赖性通路则主要激活Ⅰ型干扰素相关信号并促进靶细胞吞噬。目前,体内和体外实验均证实TLR4/NF-κB信号通路在IBD中扮演重要作用。髓样分化蛋白-1(Myeloid differentiation protei-1,MD-1)在结构序列上与MD-2存在20%同源性,常与TLR4另一家族成员防辐射蛋白105(Radioprotective 105,RP105)形成RP105/MD-1复合体调控免疫应答。RP105/MD-1在结构和功能上与TLR4/MD-2联系紧密,既往研究显示RP105/MD-1可负向调节TLR4/MD-2功能,抑制TLR4/MD-2/NF-κB信号通路的活化。目前RP105/MD-1在炎症相关疾病如动脉粥样硬化、肥胖、胰岛素抵抗和类风湿性关节炎中已进行深入研究,然而MD-1或RP105在IBD中的作用尚匮乏。因此我们分析UC患者肠黏膜和实验性结肠炎小鼠结肠组织中MD-1表达情况;采用反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,AS-ODN)灌胃特异性抑制小鼠结肠MD-1水平;观察MD-1抑制对DSS诱导的实验性结肠炎的影响及相关机制。方法:收集我中心明确诊断为活动性UC患者和健康对照者肠黏膜组织,其中UC患者12例,取结肠溃疡部位肠黏膜;健康对照组11例,取正常结肠黏膜。利用Western blot和免疫组织化学染色(IHC)检测MD-1蛋白水平并对其定位;构建3%DSS诱导的实验性结肠炎模型,进一步检测小鼠结肠组织中MD-1表达情况。人工合成MD-1 AS-ODN及其对照R-ODN,通过灌胃,提取给药后不同时间点小鼠结肠组织中的总蛋白;Western blot检测MD-1蛋白水平,确定AS-ODN对小鼠结肠组织MD-1的抑制效率及持续抑制时间。为探索MD-1在IBD中的作用,我们采用MD-1 AS-ODN抑制小鼠结肠组织MD-1表达并建立实验性结肠炎模型,将小鼠随机分为四组:DSS+AS-ODN,DSS+R-ODN,H2O+AS-ODN,H2O+R-ODN(H2O表示饮用正常灭菌水,DSS表示饮用3%DSS溶液);根据前期实验结果每60h再次给与小鼠AS-ODN至造模终点以持续抑制结肠炎造模期间MD-1表达。观察各组小鼠体重下降、大便性状、便血、疾病活动程度、造模终点小鼠结肠缩短程度。HE组织染色评估小鼠结肠组织损伤程度;免疫组化和ELISA检测髓过氧化物酶水平以确定炎症细胞浸润程度;qPCR和Western blot检测结肠组织中促炎细胞因子水平;提取结肠组织蛋白,利用qPCR和Western blot检测小鼠TLR4/NF-κB通路的活化程度。结果:我们的研究显示UC患者炎性肠黏膜中MD-1蛋白水平较健康对照组显著下降(0.7265±0.09544 vs.3.974±0.3464,P<0.001);与之一致的是,实验性结肠炎小鼠结肠组织中MD-1蛋白水平明显低于正常对照组(0.1275±0.07630 vs.1.048±0.05634,P<0.001)。免疫组化染色显示UC患者肠黏膜中MD-1表达较健康对照者降低;且MD-1主要表达于肠黏膜淋巴细胞、巨噬细胞或树突细胞而不表达于上皮细胞中,MD-1的表达定位与国外研究相一致。通过MD-1 AS-ODN灌胃给药,我们证实AS-ODN可特异性下调小鼠结肠组织中MD-1水平(0.3548±0.1543 vs.1.255±0.1703,P<0.01)且不影响其在肝脏、脾脏和肾脏中的表达(P>0.05);除此之外,通过设置时间梯度我们发现200μg AS-ODN下调结肠MD-1水平可持续60h(0.2231±0.02719 vs.0.5414±0.05094,P<0.01)。据此我们采用AS-ODN抑制结肠组织中MD-1表达并建立DSS诱导的实验性结肠炎。结果显示,在小鼠饮用正常灭菌水时,AS-ODN和R-ODN组小鼠不表现出明显的结肠炎,H2O+AS-ODN和H2O+R-ODN组在体重、DAI评分、病理损伤、炎性细胞浸润、炎症因子水平上无差异;在DSS诱导后,AS-ODN组小鼠结肠炎症明显加重:与DSS+R-ODN组相比,DSS+AS-ODN组小鼠(1)体重下降百分比和DAI评分明显升高,结肠长度显著缩短,组织损伤程度加重;(2)促炎细胞因子IL-6、IL-1βmRNA和蛋白水平显著升高;(3)TLR4、MyD88 mRNA水平升高,NF-κB通路活化相关分子磷酸化p65和磷酸化IκBα蛋白水平明显上调。结论:活动期UC患者炎性肠黏膜组织和DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织中MD-1表达水平均显著下调,提示MD-1可能参与IBD发病。利用AS-ODN特异性抑制小鼠结肠组织中MD-1水平明显加重了DSS诱导的实验性结肠炎,且MD-1抑制小鼠表现为TLR4/NF-κB活化程度增强,提示反义寡核苷酸抑制MD-1对DSS诱导结肠炎的加重作用可能与TLR4/NF-κB通路相关。