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血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)因具有很高的医药应用而受到人们的关注,其中rhPDGF-BB(recombinant human platelet derived growth factor-BB)已经在不同的宿主中得到表达,如哺乳动物细胞,昆虫细胞,酵母菌和细菌等。目前美国FDA唯一批准上市的是采用酿酒酵母表达系统生产的PDGF-BB凝胶药物,主要治疗糖尿病引起的慢性足溃疡。rhPDGF-BB在酿酒酵母中的表达量不高一直是产品高成本的主要原因,最近的的研究工作主要集中在了对其生物学功能和表达宿主的优化研究,而对于rhPDGF-BB的生产工艺优化的研究却相对匮乏。本论文主要内容是rhPDGF-BB在重组酿酒酵母中高表达的发酵条件优化与纯化工艺的研究。
本文对重组酿酒酵母生长与表达rhPDGF-BB的发酵条件,包括pH值,溶解氧,接种量,发酵温度等,做了系统的优化研究。结果显示:在重组酿酒酵母生长阶段,发酵温度控制在30℃,pH5.0,接种量10%,溶解氧大于30%,并采用葡萄糖浓度反馈方式进行补料,经过22h的培养后,细胞光密度OD600可达到35.1,开始补加半乳糖诱导rhPDGF-BB的表达;在目的蛋白表达阶段,发酵温度则控制在25℃,pH6.5,溶解氧大于30%,半乳糖浓度2%。经过在5L发酵罐中经过84h发酵,细胞光密度OD600可达到65.1,目的蛋白rhPDGF-BB表达水平占分泌总蛋白的26%,产量约为70.2mg/ml。
本文又对目的蛋白rhPDGF-BB的纯化工艺进行了优化研究。发酵完毕后,离心得到的上清液后,通过超滤进行浓缩处理,并换盐为离子交换层析的上样缓冲液(0.19mmol/L NaCl,20mmol/L Tris·HCl,pH6.0);在CM Sepharose FF离子交换层析中,采用0.5mol/L NaCl,20mmol/L Tris·HCl,pH7.4的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,再经过了Sephadex G75分子筛层析做进一步的纯化,纯化结果经胶片扫描纯度可达95%。在该纯化工艺中,rhPDGF-BB的回收率为21.9%,蛋白纯化倍数为3.65。纯化的rhPDGF-BB蛋白首先经过冻干处理,然后通过MTS法进行了生物活性检测,计算得知半有效剂量为3.05ng/ml,表明该目的蛋白具有良好的生物活性。
本论文研究建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为rhPDGF-BB的大规模生产奠定了基础。