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甘油磷脂除了构成生物膜外,还参与细胞膜对蛋白质的识别和信号传导。脂质信号的产生由多种参与脂质信号的蛋白所控制,磷脂酶是其中重要的一种。这种酶通过活化状态的改变调节信号脂质分子的含量,以应对具体的生物或非生物环境的变化。目前发现拟南芥基因组中存在六个预测编码磷脂酶C的基因,分别命名为非特异性磷脂酶C1,C2,C3,C4,C5和C6基因(NPC1-6)。目前只有日本科学家YukiNakamura对NPC4基因有过研究,提出此基因的表达受磷营养缺乏的诱导。为深入了解AtNPC4基因在植物生长发育中的生物学功能,本文主要对拟南芥中非特异性磷脂酶C4(NPC4)基因的表达模式,利用RT-PCR技术和GUS组织化学染色方法,从转录水平和蛋白质水平进行了研究。主要结果如下:
1.利用RT-PCR技术,从RNA水平探讨NPC4的表达规律取不同发育时期和不同组织器官进行RT-PCR分析,在RNA水平检测NPC4表达情况。结果发现:NPC4基因在成熟叶片中表达量比较高,在根、茎、花和种荚中表达非常微弱甚至不表达;在种子萌发早期(1到10天)几乎检测不到。该结果表明NPC4基因在发育早期不表达或非常微弱,主要在成熟叶片中表达,在幼嫩的组织器官中表达非常微弱。
2.利用GUS组织化学染色,从蛋白质水平分析NPC4的表达规律克隆了NPC4基因启始密码子ATG上游的1379 bp启动子区,并用Gateway系统构建了启动子融合GUS报告基因的载体PKG。用农杆菌介导的花沾法转化野生型拟南芥,获得阳性转基因植株,然后进行GUS组织化学染色观察,在蛋白水平检测其表达情况。结果表明:早期发育阶段,植株没有染色,说明NPC4基因在生长发育中的组织和器官中表达很微弱甚至不表达;而在成熟的植株中,能观察到染色,说明该基因在成熟的组织器官中表达,尤其是叶片中表达量最高。这与RT-PCR技术检测的结果相一致。
3.NPC4基因的诱导表达对野生型拟南芥用水杨酸(SA),甲基茉莉酸(MeJ)和脱落酸(ABA)等外源活性物质处理,通过RT-PCR和GUS组织化学染色分析,都发现NPC4基因的表达受脱落酸(ABA)的诱导,但不受水杨酸(SA)、甲基茉莉酸(MeJ)的诱导。