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ARC综合症(arthrogryposis-renal dysfunction-cholestasis,ARC)是一种常染色体隐性遗传性疾病,表现为关节挛缩、肾功能衰竭、胆汁淤滞以及血小板α-颗粒内容物的缺失,研究表明Vps33b基因突变是导致这个疾病发生的分子机制之一,因此我们推测Vps33b蛋白可能参与了α-颗粒的形成。 在本研究中,我们选用HEK293T和Meg01细胞系作为体外研究工具,利用蛋白质谱和免疫共沉淀的方法,确定了VIPAR、Sec22b和α-tubulin与Vps33b蛋白存在相互作用,并通过构建表达Vps33b不同截短体蛋白结合免疫沉淀实验发现,Vps16b与全长的Vps33b蛋白结合,而α-tubulin和Sec22b则分别与Vps33b中的两个Sec-1片段结合。荧光共聚焦显微镜结果显示,在分化的Meg01细胞生成前血小板的向外延伸的神经突触样细丝中,Vps33b复合物呈现出细丝状的分布,并且vWF阳性囊泡与Vps33b复合物存在明显的共定位现象,提示Vps33b参与了血小板α-颗粒的运输。 为了在体观察Vps33b蛋白敲除对血小板功能的影响,我们分别构建了全身性Vps33b基因敲除小鼠、巨核系/血小板特异性Vps33b基因敲除小鼠以及他莫昔芬诱导的造血干细胞Vps33b基因敲除三种小鼠模型,结果发现Vps33b基因纯合缺失的小鼠存在胚胎早期致死性,造成纯合子小鼠不能获得,对杂合子小鼠的血小板功能进行检测发现未受到明显影响;在对巨核系/血小板特异性Vps33b基因敲除小鼠的血小板进行检测时,发现Vps33b蛋白仅有部分被敲除,血小板α-颗粒的形成以及血小板相关功能仍未受到影响;但当我们对造血干细胞Vps33b基因敲除的小鼠血小板进行检测时发现Vps33b蛋白被完全敲除,并表现为血小板α-颗粒的缺失和相关聚集功能受到影响,从而阐明Vps33b蛋白确实参与了α-颗粒的形成,且有少量的Vps33b蛋白存在即可,并且发现了Vps33b蛋白的产生阶段早于巨核细胞的发生。 为了进一步证实Vps33b复合物参与血小板α-颗粒的形成,我们通过分离胎肝诱导分化原代巨核细胞,分别观察Vps33bfl/fl-Scl-Cre-和Vps33bfl/fl-Scl-Cre+小鼠巨核细胞不同分化阶段的vWF阳性囊泡(作为α-颗粒的指示标记)和α-tubulin的定位情况,发现Vps33b蛋白敲除的巨核细胞在分化阶段存在vWF阳性囊泡向远端运输障碍,vWF阳性囊泡均滞留在巨核细胞胞浆内,从而揭示Vps33b蛋白可能是通过与α-tubulin的结合参与血小板α-颗粒在胞内的运输,故而当Vps33b蛋白缺失时,血小板α-颗粒内容物运输障碍,导致血小板α-颗粒内容物的缺失。