地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)为玄参科地黄属多年生草本植物。以块根入药,用药历史悠久,临床疗效确切,是构建我国现代大中药产业链重点研究利用的大宗药材之一。但在地黄的生产中存在着严重的连作障碍问题,制约了区域经济及其相关产业的可持续发展。越来越多的研究显示:地黄化感自毒物质及其所诱导的根区微生物群落的改变是其连作障碍形成的最根本原因。因此,本研究以地黄不同生育时期根系分泌物及地黄不同根区土壤化感自毒物质与微生物变化为重点研究对象,旨在确定地黄化感自毒效应圈的动态变化规律,探明地黄潜在化感自毒物质及根区微生物与连作障碍之间的关系,为缓解地黄化感自毒效应和消减地黄连作障碍相关措施提供理论依据。其主要研究结果如下:1、地黄化感自毒效应起始于块根膨大前期,其“化感圈”(有效自毒作用范围)直径约为40cm(本实验条件下接近地黄冠幅的直径)。通过生物测试评价地黄不同生育时期根系分泌物的化感潜力。结果表明,地黄苗期(出苗后70天)至块根膨大前期(出苗后120天)的根系分泌物可促进自身种子胚根的生长;自块根膨大前期之后的地黄根系分泌物对其种子胚根的生长具有显著抑制作用,并呈逐渐增强的趋势。其中,成熟期(出苗后195天)的根系分泌物对地黄胚根长度的抑制作用最大,抑制率可达到41%。通过生物测试比较地黄不同根区土壤对自身种子生长的影响。结果表明,距离地黄块根越近,地黄种子胚根生长被抑制的作用越大。其中,根际土对胚根生长的抑制作用可达到27.5%,当距离超过20cm时地黄种子胚根的生长不被抑制。因此确定地黄自块根膨大前期开始表现出显著增强的化感自毒作用,其“化感圈”的直径约为40cm。2、丁香酸为地黄化感自毒效应的主导物质。本研究首先采用HPLC技术对地黄不同生育时期根系分泌物中5种酚酸(香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸)进行分析。结果表明,5种酚酸含量并未随地黄生育期的推进呈现单一递增或递减的趋势。进一步分析这5种酚酸与地黄种子生长的相关性发现,仅丁香酸与胚根长度存在显著负相关(r=-0.841,P<0.05)。随后,本研究又通过盆栽实验结合HPLC技术对地黄不同根区土壤中酚酸进行了分析。结果发现,在地黄根际土、根圈土(距离块根10-20cm)和根外土(距离块根20-30cm)中均含有对羟基苯甲酸、香豆酸、丁香酸、3,4-二羟基苯甲酸和香兰素,且这些物质在“化感圈”的含量显著高于根外,而根外区域几种酚酸的含量则与未种植过地黄土壤中的含量处于同一水平。表明,地黄的种植引起了土壤中酚酸类物质含量的变化,而丁香酸在地黄化感自毒作用中起主导作用,其它几种酚酸(香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、3,4-二羟基苯甲酸、香兰素)同样有协同致害的可能性。3、地黄还存在除酚酸类物质外的其它重要化感自毒物质。采用甲醇和正戊烷分别对地黄根区土壤中物质进行提取并结合GC-MS技术进行分析鉴定。结果发现,地黄种植后距离块根20cm范围内(“化感圈”范围内)的土壤中新增了 20种物质,且这些物质不存在于圈外土壤及未种植过地黄的土壤中。其中,3-oxo-2-(2-pentenyl)-,methyl ester,[1R-[1a,2b(Z)]]-(茉莉酮酸甲酯);1,3-Benzodioxole-5-carboxaldehyde,4,7-dimethoxy-(1,3-亚甲二氧基-4,7二甲氧基-5-苯甲醛);(7Z,10Z,13Z)-7,10,13-Hexadecatrienal(7,10,13-十六碳三烯醛);(9E)-9-hexadecenoicacid(9-十六碳烯酸)和 palmitoleicacid(棕榈油酸)已被报道具有较强的化感活性。因此认为这些物质同样属于地黄化感自毒物质“家族”中的成员。4、地黄植后土壤中微生物群落结构的改变及多种病原菌的产生可能与地黄连作时病害的发生有关。通过PCR-DGGE技术对地黄不同根区土壤中微生物进行分析。结果发现,根际和根圈样品所得DGGE图谱比根外样品所得图谱显示出更多微生物条带,且根际土中微生物多样性和均匀度最高,根圈土次之。经16S rDNA和18S rDNA测序分析差异条带发现,它们属于Bacteroidetes(拟杆菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、Proteobac-teria(变形菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Ascomycota(子囊菌门)、Basi-diomycota(担子菌门)及一类未定义的真菌。其中,Acremonium(支顶孢属菌),Humicola(腐质霉属),Chitinophaga(噬几丁质菌属),Micrococcus(微球菌属),Pseudomonas(假单胞菌属)和Bacillus(芽孢杆菌属)被报道属于植物的病原菌。表明,地黄种植后根区土壤中产生了多种病原性微生物,这些微生物可能与连作条件下地黄病害的发生及恶化有关。综上所述,本研究界定了地黄化感自毒效应起始时期为块根膨大前期,其“化感圈”的直径约为40cm,本实验条件下接近地黄冠幅的直径;探明了丁香酸是地黄化感自毒作用的主导物质,但不排除其它酚酸协同至害的可能性;本研究还发现了 5种地黄潜在化感自毒物质和6类潜在致病菌,这些化感自毒物质及病原微生物可能协同作用造成了地黄连作障碍问题的发生。