研究背景:组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)能够在机体内起到调控基因转录的关键作用。大量的研究表明其异常调节与肿瘤有着直接和密切的联系,所以研制和开发越来越多针对HDACs抑制作用的HDAC抑制剂(Histone deacetylases inhibition,HDACi),促使机体的乙酰化水平有所升高,从而达到治疗更多类型实体瘤和非实体瘤的前景。按照结构类型的差异,HDAC抑制剂可分为:异羟肟酸类、苯甲酰胺类、环肽类、亲电酮类等不同药效基团的小分子抑制剂,其中HDACi是通过哪些作用机制使肿瘤细胞死亡,目前为止关于这方面的研究较为透彻和深入,例如,增加细胞的凋亡性死亡,促进肿瘤细胞的分化程度,诱导细胞发生周期的阻滞作用,触发细胞自身发生自噬的作用,减少细胞的迁移能力和新血管的生成等等,从而促进肿瘤细胞的死亡。随着全球新增癌症患者的增加和世界对于新药开发节奏的加快,自2006年10月,在美国上市的SAHA作为世界上第一用于抑制HDAC的抗肿瘤药物,研发不同类别HDACi和衍生物成为当今新药开发的主流方向,特别是抗癌药物的市场随着人民生活水平而急速扩大。现有的HDACi由于靶标性和亚型选择性不强的原因,就会造成无选择性地对一些生理性的HDAC产生作用,从而产生额外的副作用和毒性。由于近年来空气污染等环境因素,肺癌的发生率急剧上升,诊断和治疗具有很大的难度,同时也是全球关注的热门和重点攻克的难题。研究目的:本课题首先通过对SAHA母体结构的特点和原子相互作用力的分析基础上,对表面识别区结构进行修饰设计,得到新的系列SAHA衍生物,并优化合成技术路线和结构鉴定,然后,进行体内外药理实验、靶点HDACs作用实验和分子模拟对接论证,以筛选出作用效果理想和或毒性低的目标衍生物,同时,观察其诱导肿瘤细胞自噬作用,以及初步探讨凋亡和自噬信号通路的分子机制,为后期的研发工作提供一定的理论基础。研究方法:通过对混合酸酐法反应路径和溶剂的优化,合成多个SAHA衍生物,对粗产物采用联合CH2Cl2、利用硅胶柱分离原理等多种方法进行纯化并用液相进行纯度的鉴定。在衍生物的结构方面,(MS-ESI+)、13C-NMR、1H-NMR和IR四种常用的方法进行鉴定。体外活性评价采用CCK-8方法,设置7个化合物浓度组,考察衍生物对多株肺癌细胞和正常细胞的抗增殖活性以及毒性作用,筛选出效果较为理想的化合物作为候选。同时从计算机分子模拟方面进行理论上的验证,使用软件Auto Dock 6.0对衍生物和作用靶点HDAC8的结合力进行测定,另外对结合力较强化合物的各个作用力参数深入的测定(包括:静电相互作用、氢键相互作用、疏水相互作用、范德华力相互作用)。另外使用Elisa法,设置5个化合物浓度组,对总HDAC抑制活性进行测定。采用酶联免疫法(Elisa)对相关的凋亡蛋白(Caspase-3、Caspase-9和Bcl-2)和自噬通路蛋白(Beclin-1)进行正反向地检测和研究。采用透射电镜观察衍生物是否能够诱导肺癌细胞产生自噬体的自噬现象。采用裸鼠皮下异种移植方法,评价其裸鼠体内的抗肺癌效果,以及观察其对心、肝、脾、肺和肾重要脏器的影响。通过Bliss法测定衍生物昆明小鼠腹腔注射给药的LD50值,考察其急性毒性作用。研究结果:优化混合酸酐法反应路径和条件后,成功地合成A系列化合物(N34、N4I、N4B、N24),其产率得到了较大的提高(56.3%~72.5%),完成了相关的结构鉴定(MS-ESI+、13C-NMR、1H-NMR和IR)和纯度鉴定(>95%)。在系列A化合物体外抗肺癌细胞的研究中,均能表现出对肺癌细胞株较好的抗增殖效果,对正常细胞的毒性小,与阳性药物SAHA对比,N34和N4I对SPC-A-1细胞株的药效强且敏感,其中N34的IC50=0.9678μM为SAHA的1/4之多,呈现良好的构效关系。对总HDAC抑制活性的筛选中,在SPC-A-1细胞株中N34的IC50=0.04379μM,达到纳摩尔级别。通过计算机分子模拟与受体HDAC8的作用力测试中,N34与晶体内部的氨基酸残基结合表现最为突出,其自由能、静电能和氢键作用力等均比SAHA强。对相关凋亡和自噬的蛋白研究中,N34能明显提升Beclin-1、Caspase-3,Caspase-9蛋白表达的水平,在下调Bcl-2表达水平的同时,抑制Caspase凋亡途径的信号通路后,可以较为明显地观察到Beclin-1蛋白水平的上调。B系列衍生物(N3F、N2E)的体外实验中,N3F同样能够较好地抑制肺癌细胞株(SPC-A-1)的增殖,且影响正常细胞的增殖方面较少。B系列化合物N3F和N2E的小鼠腹腔注射LD50分别是183.7501mg/kg(95%置信区间为118.3983 mg/kg≤LD50≤285.1738 mg/kg)和312.7871mg/kg(95%置信区间为165.0207≤LD50≤592.8696)。在药效评价和筛选中,选用皮下移植异种的荷瘤裸鼠,采用灌胃给药方式,15天后对肿瘤体积和重量、裸鼠体重和脏器分配系数进行监测,结果显示高、中剂量的N3F能够明显地抑制肺癌实体瘤的生长,且能将抑瘤率提升到50%以上;给药期间,各组荷瘤裸鼠均存活,体重均有不同程度的下降,随剂量的减少,体重减少越多,高剂量组对体重影响比SAHA的小,在脏器分配系数中,仅肝脏的分配系数增大,说明其存在一定的毒副作用。通过透射电子显微镜的观察,能看到N3F诱导肺癌细胞发生自噬的现象。研究结论:针对SAHA为母体,对其表面识别区进行修饰,成功地得到系列衍生物(N34、N4I、N43、N24),并通过对混合酸酐法中所需的试剂和反应条件的优化进行合成,其产率得到明显改善,说明该优化后的合成路径较为理想。A系列化合物对多株肺癌细胞均表现出良好的抗增殖作用,其中N34对SPC-A-1细胞株的作用尤为突出,其作用强度和对靶点HDACS作用分别是SAHA的4倍多和10倍多,对正常细胞的毒性小,呈现良好的构效关系;分子对接也证实了其晶体内部氨基酸残基的结合能力表现最为突出,自由能、静电能和氢键作用力等均比SAHA强;有显著的上调自噬蛋白和凋亡蛋白表达的作用。N3F对多株肺癌细胞增殖和裸鼠皮下肺癌荷瘤生长均有显著的抑制作用,且能够诱导肺癌细胞自噬作用,效果均比原药SAHA好,对肝脏有一定的不良作用,裸鼠体重也有所下降,但较原药SAHA的轻。N3F和N2E的小鼠腹腔注射LD50分别是183.7501mg/kg和312.7871mg/kg。本课题研究表明,以原药为结构母体进行修饰设计的系列衍生物,其药理作用基本能够达预期的效果。