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慢性肾衰竭(Chronic renal failure,CRF)的并发症之一进行性营养不良是许多患者面临的难题,表现为血白蛋白减少、贫血、骨骼肌萎缩、机体蛋白质储备下降等。我国约有20%~50%的CRF患者发生营养不良。营养不良与患者的预后不良密切相关,可导致免疫功能低下、继发感染、贫血、心血管事件发生率增加、甚至多脏器衰竭,使死亡率上升。据统计CRF患者中9.6%的死亡事件与严重营养不良有关,因此营养不良CRF的重要危险因素。CRF营养不良病因众多,发病机制复杂,蛋白质摄入减少,酸中毒、内分泌代谢异常,透析丢失蛋白质,炎症等多种原因均可导致营养不良。目前临床治疗主要使用复方α-酮酸(开同)等治疗CRF营养不良,但其价格较昂贵,在临床应用中有局限。因此,如何经济有效地预防、治疗CRF营养不良,是肾脏病领域亟需解决的问题。 CRF并发的营养不良是一种由蛋白质过度消耗导致的营养失衡状态,蛋白质代谢与疾病的进展密切相关。骨骼肌组织蛋白质储量丰富,是蛋白质代谢的主要场所,骨骼肌的营养状况可以直接反应蛋白质的代谢变化。在CRF状态下,由于蛋白质代谢失衡引起骨骼肌蛋白质水平下降,并直接导致体重降低。体重下降是CRF营养不良最重要的诊断指标和临床表现,而骨骼肌萎缩是重要的病理结果和评估指标。蛋白质的代谢失衡包括了蛋白质合成代谢减少和分解代谢增加,在CRF营养不良中起主导作用。在分子生物学方面,许多信号通路都参与对骨骼肌萎缩及肥大的调控。代谢性酸中毒、尿毒症毒素、微炎症状态等可严重抑制蛋白质合成代谢途径,蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白酶(Akt/mTOR)信号通路明显下调。 除了蛋白质的代谢失衡的原因,骨骼肌萎缩的过程中存在骨骼肌再生修复机制受损。骨骼肌卫星细胞(skeleton satellite cell,MSC)的激活、增殖与分化对肌肉的再生起了决定性的作用。在CRF营养不良的环境下,毒素蓄积、酸中毒、内分泌失常、营养元素缺乏、全身炎症状态、机体内环境紊乱等能抑制MSC的激活、生长、分化过程。而长期营养不良MSC死亡后无再生替代。根据这一变化,许多学者认为MSC数量减少甚至完全耗竭是造成CRF营养不良肌肉不断萎缩的重要原因。肌肉组织中,Wnt7a可以提高MSC的数量,修复骨骼肌损伤,加速骨骼肌的生长。经由Wnt7a的受体Fzd7,激活下游的AKT/mTOR信号通路,促进肌管肥大和肌纤维增加。 另外,骨骼肌的消耗的机制之一是肌细胞核数量的减少,这主要是通过细胞凋亡途径丢失的。在骨骼肌消耗的状态下,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调,促凋亡蛋白Bax、caspases的表达增加,说明在分解代谢状态下,线粒体途经的凋亡发挥着重要作用。自噬的发生与骨骼肌细胞损伤也有密切的关系,是真核细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和内部生物大分子物质的过程。目前认为绝大多数长半衰期蛋白质的降解有细胞的自噬的参与。自噬的活化可导致蛋白分解和肌肉萎缩。虽然大量研究表明细胞内蛋白质合成代谢途径Wnt7a-Akt/mTOR信号通路受损、肌细胞凋亡及自噬增加是导致骨骼肌萎缩的重要原因,但它们在CRF骨骼萎缩中的作用及机制尚缺乏研究。 CRF营养不良导致的骨骼肌萎缩,属于中医的“虚劳”、“痿症”等的范畴。CRF的病机为本虚标实,虚实夹杂。本虚即脾肾虚衰,标实为痰饮水湿浊毒。CRF时,患者的脾胃功能虚弱,水谷精微化气行血受阻,脏腑形质失养,功能失职,从而产生痰饮、水湿、浊毒等。因此,CRF营养不良病位在肾,关键在于脾。在CRF营养不良的全过程中脾胃功能失调贯彻始终。故治疗上,当攻补兼施,正邪兼顾,治以补脾益肾、滋养气血、泄湿排浊,扶正不留邪,祛邪不伤正。肾衰营养胶囊是魏教授据多年临床经验在“人参养荣汤”基础上筛选药物组方精制而成,在临床上应用多年,具有益肾健脾、补气活血、通腑泻浊的功效,是有确定疗效的预防和治疗CRF营养不良的药物。临床观察表明,该方可以使患者的生活质量有所改善,增加患者的食欲,增加体重,改善贫血,提高血浆白蛋白水平,但其作用的分子作用机制尚不明确,有待进一步研究。 本课题通过观察肾衰营养胶囊对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导形成的小鼠C2C12骨骼肌细胞萎缩模型的影响,检测小鼠C2C12骨骼肌Wnt7a-Akt/mTOR信号通路、肌细胞凋亡及自噬信号通路的表达,初步探讨肾衰营养胶囊促进骨骼肌蛋白质合成、MSC修复,拮抗MSC损伤,从而预防和改善骨骼肌萎缩及其相关的分子机制,为肾衰营养胶囊防治CRF营养不良,提供实验依据。具体如下: 第一部分肾衰营养胶囊对C2C12肌管Wnt7a-Akt/mTOR信号通路的影响 目的:观察肾衰营养胶囊对TNF-α诱导C2C12骨骼肌肌管萎缩的改善作用,并探索改善骨骼肌萎缩、蛋白质合成的相关分子机制。 方法:首先10%胎牛血清培养C2C12成肌细胞,再用2%马血清分化培养基使C2C12成肌细胞分化成肌管。将培养的C2C12肌管分成4组,1组为正常血清组,其他3组用含有20 ng/mL TNF-α的培养基干预C2C12骨骼肌肌管,制造骨骼肌萎缩的模型,其中分别两组添加肾衰营养胶囊含药血清和开同含药血清。4组分别为:正常血清组,TNF-α模型对照组,TNF-α+10%肾衰营养胶囊含药血清组,TNF-α+10%开同含药血清组。每组均孵育24h之后进行细胞固定、染色,采用伊红-苏木素(HE)染色法。各组在200倍光镜下拍照,各组肌管的平均横径用Image Pro-Plus软件计算;采用Western blot法检测各组Wnt7a、frizzled-7、p-Akt、p-mTOR的表达含量。采用GAPDH作为内参照。 结果:与正常对照组相比,TNF-α模型组的肌管横径明显减小,肾衰营养胶囊及开同可以改善横径减小的程度,组间的比较均有统计学意义(P<0.05),而肾衰营养胶囊组与开同组之间肌管横径比较无差异;Wnt7a、frizzled-7、p-Akt、p-rmTOR在正常组中均有明显或零散表达,TNF-α模型组中p-Akt、p-mTOR、Wnt7a、frizzled-7的表达量明显减少,而肾衰营养胶囊及开同能够恢复模型组信号因子的异常表达,组间的比较均有统计学意义(P<0.05),而肾衰营养胶囊及开同组之间相比,p-Akt、p-mTOR、Wnt7a、frizzled-7的表达量均无差异。 结论:TNF-α可使骨骼肌萎缩,肌管横径减小,抑制Wnt7a-Akt/mTOR信号通路。肾衰营养胶囊可恢复Wnt7a-Akt/mTOR信号通路水平,使肌管横径增大,从而改善骨骼肌萎缩的状态。 第二部分肾衰营养胶囊对C2C12成肌细胞Bcl-2/Bax凋亡途径的影响 目的:观察肾衰营养胶囊对TNF-α诱导的C2C12成肌细胞凋亡的改善作用,并探索凋亡相关的分子机制。 方法:将培养的C2C12成肌细胞分成4组,1组为正常血清组,其他3组用含20 ng/mL TNF-α的培养基培养,并分为:TNF-α模型对照组,TNF-α+10%肾衰营养胶囊含药血清组,TNF-α+10%开同含药血清组。孵育24h后用Hoechst33342染色法检测各组C2C12成肌细胞凋亡状况;用Western blot法对各组Cleaved caspase3、B淋巴细胞瘤-2基因相关蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达量进行检测。 结果:与正常对照组相比,TNF-α模型对照组C2C12成肌细胞的凋亡率明显上升,与TNF-α模型对照组相比,经肾衰营养胶囊及开同干预后能显著减少凋亡,以上比较均有统计学意义(P<0.05);与正常对照组相比,在TNF-α模型组中,Cleaved caspase3、Bax表达显著增加,Bcl-2表达减少。相对于模型组,肾衰营养胶囊及开同能够显著下调Cleaved caspase3、Bax表达,恢复Bcl-2表达量,以上比较均有统计学意义(P<0.05)。 结论:肾衰营养胶囊对TNF-α诱导的C2C12成肌细胞凋亡具有改善作用,其机制可能是能通过调节Bcl-2/Bax凋亡途径实现的。 第三部分肾衰营养胶囊对C2C12成肌细胞自噬的影响 目的:观察肾衰营养胶囊对TNF-α诱导的C2C12成肌细胞自噬的抑制作用,并探索自噬相关的分子机制。 方法:将培养的C2C12成肌细胞分成4组,1组为正常血清组,其他3组用含20 ng/mL TNF-α的培养基培养,并分:TNF-α模型对照组,TNF-α+10%肾衰营养胶囊含药血清组,TNF-α+10%开同含药血清组。孵育24h后用投射电镜检测各组C2C12成肌细胞自噬状况;用Western blot法对各组LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、beclin-1表达量进行检测。 结果:与正常对照组相比,TNF-α模型对照组C2C12成肌细胞的自噬率明显上升,与TNF-α模型对照组相比,经肾衰营养胶囊及开同干预后能显著减少自噬,以上比较均有统计学意义(P<0.05);与正常对照组相比,在TNF-α模型组中,LC3B-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1表达显著增加,相对于模型组,肾衰营养胶囊及开同能够显著下调LC3B-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1表达,以上比较均有统计学意义(P<0.05)。 结论:肾衰营养胶囊对TNF-α诱导的C2C12成肌细胞自噬具有抑制作用,其机制可能是能通过调节自噬相关蛋白水平实现的。