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薄皮甜瓜(Cucumis melo var.makuwaMakino)是我国重要的经济作物之一,在中国和东亚国家广泛分布。其果实香气浓郁,深受消费者喜爱。薄皮甜瓜的变种及品种丰富,不同变种及品种间的香气差异较大,对其果实的品质影响突出。前人的研究发现脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)途径是植物香气物质合成的重要途径之一,植物中的酯类、醇类、醛类等多种香气物质的主要成分均来源于此。醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是LOX途径的关键酶,研究其在植物香气物质合成中的作用对于调控和改良果实品质有重要意义。随着2012年甜瓜基因组的释放,大量的ADH-like DNA片段被发现,我们课题组从中鉴定了 12个CmADHs,分别命名为CmADH1-12,然而CmADHs在甜瓜香气物质合成中功能尚不明确。因此,我们以薄皮甜瓜浓香型(C.melo var.makuwa Makino)"彩虹"、淡香型"翠宝"及甜瓜的变种(C.melovar.flexuosus Naud)青香型"菜瓜"为试材,研究了 CmADHs在3种类型甜瓜香气合成中的作用,并克隆了受香气合成底物乙醇和乙醛诱导上调且分别在薄皮甜瓜浓香型"彩虹"、淡香型"翠宝"中高水平表达的CmADH12和青香型"菜瓜"中特异表达的CmADH4,同时为了验证两个基因的功能,分别进行了原核表达和在甜瓜果实中瞬时表达,主要的研究结果如下:1.比较了浓香型"彩虹7号"、淡香型"翠宝"和青香型"菜瓜"成熟果实的主要品质指标、香气物质种类及含量,进行了主成分分析,同时测定了CmADH 基因家族成员的表达量,结果表明:"彩虹"成熟果实中的总香气物质含量最高,为307.96μg·g-1FW,"翠宝"和"菜瓜"的总香气含量相似分别为169.15 μg·g-1FW和144.60μg·g-1FW。"彩虹"和"翠宝"果实中酯类物质为主要香气成分,分别为总香气物质含量的67%和75%,"菜瓜"成熟果实中醇类物质为主要香气成分,占总香气物质含量的94%。3种甜瓜中共检测到49种香气物质,主成分分析表明,影响3者香气差异的关键物质为乙酸乙酯、乙酸己酯、(E,Z)-3,6-壬二烯醇和2-乙基-2-己烯醇。CmADH1、CmADH2、CmADH3、CmADH6、CmADH12在"彩虹"和"翠宝"果实中表达较高,且伴随果实成熟呈现先上升后下降的变化;CmADH1、CmADH4、CmADH7、CmADH12在"菜瓜"中表达含量较高,且CmADH4仅在"菜瓜"中高水平表达,可能在其香气特征的形成中发挥一定作用。2.为了进一步明确参与香气物质合成的CmADHs成员,以"翠宝"为试材,在果实成熟过程中,我们使用乙酯类香气物质的合成前体乙醇、乙醛和ADH的竞争性抑制剂4-甲基吡唑(4-methylpyrazole,4MP)为前体,进行果肉圆片孵育,并分析了CmADHs成员对几种底物的响应。结果表明:CmADH4和CmADH12受乙醇和0.1 mM的4MP诱导上调表达,CmADH1,CmADH4、和CmADH12受乙醛处理上调表达,CmADH9在所有处理中均上调表达。其余CmADHs家族成员的表达均受到外源物质不同程度的抑制。乙醇对ADH活性抑制的效果较4MP更为显著。孵育后CmADH3和CmADH12的表达与乙酸乙酯和乙酸己酯的含量变化趋势相似,暗示了两者可能与两种直链酯类产生有一定关系。3.克隆了CmADH4 和CmADH12两个基因完整的ORF,并对CmADH4和CmADH12的蛋白性质进行了生物信息学分析。结果表明:CmADH14和CmADH12的核苷酸长度分别为1146 bp和1908 bp。CmADH4与基因组网站上的序列相比在第1159处发生了同义置换,将原本的碱基T置换为C,但其翻译后的氨基酸序列并没有发生变化;CmADH12的核苷酸序列与基因组网站上的序列完全一致。CmADH4和CmADH12 都具有中链醇脱氢酶(Medium-chain alcohol dehydrogenase,MDR)的结构特征,CmADH12 还具有短链醇脱氢酶(Short-chain alcohol dehydrogenase,SDR)的结构,预测两者均为非分泌型蛋白,其中CmADH4定位在细胞质内,CmADH12定位在高尔基体。4.为了明确两个CmADH的功能,我们将CmADH4和CmADH12基因去除终止密码子的ORF连接到pET30a原核表达载体中,通过大肠杆菌BL21(DE3)系统诱导目的蛋白的表达,再利用Ni亲和柱层析的方式分离纯化目的蛋白。获得纯化的重组蛋白后,用不同类型的醛为底物,设定温度和pH梯度进行酶活性检测,以分析重组蛋白的酶学特征。结果表明,我们成功诱导并纯化了 CmADH4重组蛋白,去掉组氨酸标记后,其蛋白大小为41KD左右,与预测大小相符,CmADH4重组蛋白的最适反应温度为30 ℃,还原反应的最适pH为6,对直链脂肪醛:乙醛和己醛有较高的催化能力,对支链醛和芳香醛的亲和能力较低。5.初步建立了基因在薄皮甜瓜果实中的瞬时转化体系,将CmADH4和CmADH12去除终止密码子的ORF构建到含有35s启动子的表达载体pCAMBIA3301-LUC中,通过筛选不同的根癌农杆菌菌株和注射条件,最终确定使用EHA105菌株注射甜瓜果实赤道上方的果肉实现CmADH4和CmADH12在薄皮甜瓜果实中的瞬时表达。结果表明,CmADH4和CmADH12成功在甜瓜果实中瞬时表达,与空载对照相比,携带CmADH4和CmADH12重组质粒的菌液注射后显著的提升了果肉中CmADH4和CmADH12的表达量。CmADH4超表达果肉中的ADH总酶活性显著提升,同时伴随着果肉中乙酸乙酯,乙酸己酯和(E,Z)-3,6-壬二烯醇的含量超量积累,其中(E,Z)-3,6-壬二烯醇的含量变化幅度最大,达到对照的5倍以上。CmADH12的超表达使果肉中的CmADH12基因表达水平显著升高,但酶活性和差异香气物质含量并未发生显著改变,我们推测是由于CmADH12结构的复杂性,导致蛋白翻译过程受限无法迅速合成有活力的蛋白,而且薄皮甜瓜翠宝中CmADH12的基础表达水平较高,导致其超表达引起的酶活及产物含量改变不显著。