论文部分内容阅读
目的:近年来,随着全球市场对天然药物的需求持续增长,草药产业已成为我国最具特色的传统优势产业之一。民族药作为我国传统医药的重要组成部分,越来越多受到人们的关注,其中蒙药摄取了藏医、中医等其他民族在实践中得到的相关技能与理论,蒙药方剂流传下来并有疗效的达数千首,常用制剂有400多首,其中蒙药复方制剂德都古日古木-7(G-7)为治疗肝病的特色药,收载于《中国人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》(1998年版),鉴于原标准中收载的相关定性定量指标不够全面,为有效控制该复方制剂的内在质量,保证药物的品质,建立可靠且准确的实验方法是非常重要的。为解决部颁标准中检测方法的单一性,本课题对G-7进行了真伪优劣的研究,以期为复杂组方的成药制剂建立一种全面有效的质量评价方法,推进复方制剂的质量标准研究。方法:首先收集蒙药复方制剂G-7处方规定的原料药材作为对照,经性状鉴别和DNA条形码分子鉴定法两种方法对原料药材进行鉴定,以确保对照药材来源准确;然后根据《中国人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》规定方法自制2份G-7对照样品(RS01和RSO2),RSO2加入人参作为阳性对照;此外,收集3份市售G-7样品(SS01-SS03),及内蒙地区12份院内制剂G-7样品(YN01-YN12)。以4种不同的基因区ITS、ITS2,rbcL和matK作为分子标记片段,对2份对照、3份市售及12份院内制剂G-7样品基于Illumina NovaSeq 6000测序平台进行高通量测序。将测序得到的clean data通过过滤去除低质量序列,高质量序列通过组装和序列评估,然后对测序深度和覆盖度进行计算,去除测序深度小于3和覆盖度低于95%的不可靠序列;使用TCM-BOL数据库、GenBank和BOLD数据库进行药材基原鉴定。使用高效液相色谱法(HPLC)对3份市售及12份院内制剂G-7样品中的羟基红花黄色素A和没食子酸进行含量测定和样品间比较。色谱柱采用YMC-Pack ODS-A(250 × 4.6 mm,5 um);柱温30℃;以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)为流动相,梯度洗脱0-9 min:5%A,9-30 min 5%-12%A,30-40min 12%-100%A,流速 1.0 mL/min,检测波长分别为 274nm 和 400nm,进样量10 uL。结果:本研究基于高通量测序技术共获得约120 G的原始数据,约8亿个reads,经处理后获得500,000余条高质量序列,分析结果显示结合4种DNA条形码ITS、ITS2、rbcL和matK可检出2份对照样品中规定的全部生物组分,且RSO2能够检出阳性对照药材人参Panaxginseng C.A.Mey,表明该方法具有良好的准确性、稳定性和重复性,同时显示ITS和ITS2序列的鉴定效率比rbcL和matK序列的鉴定效率高。结合ITS2、rbcL和matK序列在3份市售G-7样品中检出均检出4味原料药材,在12份院内制剂G-7样品中检出的原料药材数目不一,其中检出组方物种数最多的是YN04样品,共检出5味原料药材,检出组方物种数最少的是YN11样品,只检出2味原料药材;此外,在15份样品中只有YN12样品中检出正品药材木通Akebia quinata,其余样品均不同程度检出木通的常见混伪品小木通Clematis armandii和威灵仙 Clematis chinensis,在YN02样品中检出关木通Aristolochia manshuriensis。本研究基于高效液相色谱法(HPLC)对红花和诃子中的主要成分羟基红花黄色素A和没食子酸进行含量测定,结果显示两种成分分别在各自的线性范围内具有良好的线性关系,其中羟基红花黄色素A的回归方程为:y=2×107x-293586,r2=0.999;没食子酸的回归方程式:y=3×107x-64310,r2=0.999。3份市售G-7样品羟基红花黄色素A和没食子酸两种成分的含量相近,说明3份市售G-7样品的质量无明显差异;12份院内制剂G-7样品两种物质的含量存在明显差异,其中YN09含有的羟基红花黄色素A最高,YN02含量最低;YN08含有的没食子酸最高,YN07含量低。结论:高通量测序技术可有效鉴定蒙药复方制剂G-7中的生物组分,对于复方制剂的质量评价应包含处方成分的鉴定又包括有效成分的含量测定。因此,将高通量测序技术与高效液相色谱法相结合,对复方制剂的质量评价提供新的思路和方法。