背景:　　 肿瘤的发生、发展与机体免疫之间的关系一直是研究者长期关注和探索的课题。一方面恶性肿瘤能抑制机体的免疫力,另一方面,免疫力的降低又加速恶性肿瘤的发展。因此如何打破这一恶性循环是肿瘤治疗取得成功的关键之一。人类致力于肿瘤免疫的研究经历了100多年的历史,形成了完整的理论体系,并建立了包括非特异性免疫治疗、肿瘤疫苗、过继细胞免疫治疗、细胞因子免疫治疗、单克隆抗体治疗、放射免疫治疗等一系列的免疫疗法。肿瘤免疫治疗的基本思路是通过相关技术方法调动宿主的免疫系统的抗肿瘤免疫应答能力,消灭已经形成的肿瘤细胞或抑制其进一步发展。　　 随着科学技术和方法学的进步,越来越多的肿瘤抗原被鉴定出来,研究者发现,很多肿瘤抗原的免疫原性并不弱,并且在荷瘤动物或肿瘤患者体内也常发现有识别这些抗原的特异性细胞毒T淋巴细胞存在,即便如此,肿瘤仍然能避开机体的免疫反应而在局部维持和进展。在树突状细胞疫苗抗肿瘤的临床研究中,大部分接受DC疫苗治疗的患者体内检测到了肿瘤抗原特异性免疫反应,说明DC疫苗确实激发了特异性免疫反应,但从临床疗效上看,能够使肿瘤缩小的客观有效率却让人失望。在许多肿瘤组织中常常有浸润性淋巴细胞(TIL)存在,但很少观察到这些TIE诱导了肿瘤排斥反应。同时虽然机体对已经存在的肿瘤不能产生免疫排斥,但是荷瘤机体却对其他部位新移植的相同肿瘤能产生免疫排斥(伴随的肿瘤免疫现象)。在临床上增强患者全身免疫功能后,可检测到患者免疫细胞数量的增加、功能的增强,细胞因子分泌增多,但很少见到肿瘤的消退。从以上现象分析,虽然机体对肿瘤抗原产生了免疫反应,但免疫反应在肿瘤局部却起不了作用,在肿瘤局部免疫功能似乎受到了明显的抑制。　　 研究发现主要因为是肿瘤患者免疫功能状态并不能直接反应机体抗肿瘤免疫效应,即使患者全身的免疫功能得到改善,但肿瘤微环境内的免疫效应却是仍处于抑制状态。肿瘤微环境是肿瘤细胞在其发生发展过程中所处的内环境,由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞,如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成。作为肿瘤免疫效应阶段的执行场所,肿瘤微环境内存在多种因素参与局部的免疫抑制状态的产生,包括:局部效应细胞功能障碍、抑制性免疫调节细胞Treg、细胞因子的免疫负调节作用、抑制性配体受体反应、效应细胞的代谢活性负调节、肿瘤细胞本身的作用等。在肿瘤组织微环境中,上述因素共同作用,形成了肿瘤局部微环境中免疫特有模式。肿瘤细胞不仅被动的逃避免疫系统的攻击,同时也主动的抑制其生长环境中的免疫细胞的正常功能。这些因素为开辟新的肿瘤免疫治疗方案提供了思路。　　 目前的各种免疫治疗方法均不能有效改善肿瘤微环境中免疫功能抑制状态,导致治疗效果不理想,尚没有较好的方法打破肿瘤内环境对免疫细胞的抑制作用。为解决这一问题,我们从临床器官移植后发生的超急性排斥反应得到启发,受者体内预先存在有抗供者组织抗原的抗体。它们可与抗原相结合,通过激活补体而直接破坏靶细胞,或通过补体激活所产生的活性片段引起血管通透性增高和中性粒细胞浸润,导致毛细血管和小血管内皮细胞损伤、纤维蛋白沉积和大量血小板聚集,并形成血栓,从而使移植器官发生不可逆性缺血、变性、坏死。我们是否可以设计让肿瘤细胞产生体内已有抗体的抗原,进而导致急性排斥反应的发生,达到增强局部免疫功能,有效杀伤肿瘤细胞的效果呢?人ABO血型系统似乎可以提供帮助。我们只要设计相应的表达抗原的基因,导入肿瘤细胞,让其表达抗原蛋白后即能产生急性排斥反应。　　 根据这一设想,我们设计了整体的实验步骤。具体包括以下几方面:　　 (1)人血型B抗原模拟多肽的获取　　 (2)人血型B抗原模拟多肽、Mip3 β双表达重组质粒的构建及鉴定　　 (3)人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒转染后外源蛋白表达对抗肿瘤效应的影响　　 第一部分 人血型B抗原多肽序列的获取　　 目的:模拟人血型B抗原多肽,获得阳性克隆P1。方法:使用随机12肽库筛选试剂盒,按照试剂盒说明书应用常规M13方法筛选人血型B抗原模拟多肽,并行ELISA检测,挑选阳性克隆P1。结果:获得6条一致阳性克隆P1,测序结果为AGAAGAATAAGACATCTGCGTATGCTTAAGAGAATG,其氨基酸序列为HSLKHTQMSYSS。结论:应用随机12肽文库成功获得人血型B抗原模拟多肽。　　 第二部分 人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒的构建及鉴定　　 目的:构建人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒。方法:扩增巨噬细胞炎症蛋白3 β基因。双酶切后克隆入质粒pIRES的多克隆位点B(MCSB),构建P1/Fas-Mip3β-pIRES表达质粒。PCR扩增血型B抗原模拟多肽P1和Fas基因的跨膜区及胞内段,酶切后连接成P1/Fas融合基因。双酶切P1/Fas融合基因后克隆入真核表达质粒pIRES的多克隆位点A(MCS A)。转化DH5 α感受态细菌,筛选鉴定阳性克隆,提取质粒。酶切鉴定,测序验证重组质粒插入序列的正确性。转染人黑色素瘤细胞株B16细胞,分别利用PT-PCR检测肿瘤细胞转染前后外源基因mRNA的转录情况,流式细胞技术,荧光显微镜观察转染前后外源基因的蛋白表达。结果:(1)成功构建人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒；(2)人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒于人黑色素细胞B16转染成功,转染效率为:76.95±5.21％,并通过mRNA及蛋白水平检测。结论:利用噬菌体展示技术成功制备了人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒。　　 第三部分 人血型B抗原模拟多肽、Mip3 β双表达重组质粒在人黑色素细胞B16转染后外源蛋白表达对抗肿瘤效应的影响　　 目的:将人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒于人黑色素细胞B16转染,检测其对抗肿瘤效应的影响。方法:选用人黑色素瘤细胞株B16,设4个组,A组:转染P1/Fas-Mip3 B-pIRES组,B组:转染P1/Fas-pIRES组,C组:转染Mip3 β-pIRES组,D组:转染pIRES组。转染方法采用Invitrogen(美国)公司的LipofectamineTM2000脂质体转染的方法(6孔板,8×105孔,2ml体系)。分别流式细胞仪检测细胞凋亡率,进行体外补体介导的细胞杀伤(CDC)实验和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实验,获得细胞活力并进行统计学分析。结果:(1)流式细胞仪检测双表达组组细胞凋亡率87.6％,明显较其他组别高。(2)CDC试验发现不同质粒组之间差异有显著性(F=223.045,P<0.001),多重比较结果显示P1/Fas-Mip3β-pIRES组与各组有显著性差异(p<0.001,均数低于其他各组),Mip3β-pIRES组与pIRES组无显著性差异。不同浓度之间差异无显著性(F=2.611,P=0.087),多重比较结果显示2.5ug/ul组与20ug/ul组有明显差异(p<0.05),其余组间比较无显著性差异。结合基本统计量输出结果,最小均值的组合为20ug/ul组P1/Fas-Mip3β-pIRES。(3)ADCC试验发现不同效靶比之间差异有显著性(F=18.306,P<0.001),多重比较结果显示40:1与各组有显著性差异(p<0.001,均数低于其他各组),10:1组与20:1组无显著性差异。不同质粒组之间差异有显著性F=84.609,P<0.001,多重比较结果显示P1/Fas-Mip3β-pIRES组与各组有明显差异(P<0.001),并且均数低于其他各组。结合基本统计量输出结果,最小均值的组合为40:1组P1/Fas-Mip3β-pIRES。结论:人血型B抗原模拟多肽、Mip3β双表达重组质粒能在人黑色素细胞B16转染,诱导肿瘤细胞凋亡,并通过CDC及ADCC效应增强免疫反应。