【摘 要】
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鲤（Cyprinus carpio）是我国重要的淡水养殖鱼种。2020年我国鲤养殖总产量为289.7吨（自《2021年中国渔业统计年鉴》）,约占国内淡水养殖总产量的9.6%。随着养殖产量的不断提高,鲤养殖中病害频发,对鲤养殖产业的健康发展产生了重大影响。因此,揭示鲤免疫系统抵御病原微生物入侵的分子机制,研制疫苗和免疫增强剂,以有效防控鲤重要疾病的发生,则是目前亟待解决的问题。细胞因子（Cytoki
【基金项目】
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国家重点研发计划“蓝色粮仓”科技创新专项,“重要水产动物病害免疫与生态防控技术集成示范”课题（2019YFD0900105-1）；
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鲤（Cyprinus carpio）是我国重要的淡水养殖鱼种。2020年我国鲤养殖总产量为289.7吨（自《2021年中国渔业统计年鉴》）,约占国内淡水养殖总产量的9.6%。随着养殖产量的不断提高,鲤养殖中病害频发,对鲤养殖产业的健康发展产生了重大影响。因此,揭示鲤免疫系统抵御病原微生物入侵的分子机制,研制疫苗和免疫增强剂,以有效防控鲤重要疾病的发生,则是目前亟待解决的问题。细胞因子（Cytokine,CK）是一类由免疫系统或造血系统中活化的细胞分泌的一类具有广泛生物活性的低分子质量蛋白或多肽。细胞因子可分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子和生长因子等。自1957年IFN被发现以来,已陆续有200多种细胞因子被发现,它们与相应的受体结合,通过自分泌、旁分泌或内分泌的方式,发挥调节免疫应答、促进免疫细胞增殖分化、参与组织修复等免疫学功能。在细胞因子中,白细胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）细胞因子家族在自身免疫和炎症性疾病中具有重要功能。IL-17家族有6个成员（IL-17A～IL-17F）。IL-17A和IL-17F在哺乳动物中研究较多,发现其可参与机体免疫应答和多种自身免疫性疾病的发病过程。近年来,鱼类中IL-17A和IL-17F的同源物IL-17A/F及其受体已被克隆鉴定,但对其功能研究较少。本文以黄河鲤为研究对象,对IL-17A/Fs分子特征和功能进行研究,主要研究结果如下:1.克隆并鉴定了IL-17A/F1a和IL-17A/F1b基因,两个基因的ORF（Open reading frame）全长均为480 bp,编码159个氨基酸。经在线软件Signal P预测,IL-17A/F1a前27个氨基酸为信号肽,IL-17A/F1b前31个氨基酸为信号肽。多序列比对和同源性分析发现,IL-17A/F1a和IL-17A/F1b与草鱼IL-17A/F1的氨基酸相似性最高,分别为76.3%和75.7%。系统进化树发现IL-17A/F1a和IL-17A/F1b与其它硬骨鱼IL-17A/F1聚为一支,表明其在进化关系上具有高度的保守性。2.采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测了黄河鲤IL-17A/F1a和IL-17A/F1b在不同器官组织中的m RNA表达水平,结果显示,黄河鲤IL-17A/F1a和IL-17A/F1b在不同器官组织中均有表达,其在肝脏、皮肤和大脑中表达量较高,其次是肌肉、鳃和肠道,在脾脏和头肾中表达量较低。腹腔注射嗜水气单胞菌（Aeronmonas hydrophila）12 h后,黄河鲤鳃和头肾中IL-17A/F1a和IL-17A/F1b的m RNA表达水平均显著上调,并在24 h达到最高点,表明黄河鲤IL-17A/F1a和IL-17A/F1b在机体抵御病原菌入侵的过程中发挥了重要的免疫应答作用。3.分别将IL-17A/F1a和IL-17A/F1b去除编码信号肽的CDS片段插入p ET-32a质粒构建原核表达载体,然后转入BL21（DE3）大肠杆菌（Escherichia coli）表达目的蛋白,然后通过镍柱对重组蛋白进行纯化,分别获得了IL-17A/F1a和IL-17A/F1b蛋白。分离鲤头肾巨噬细胞,分别与IL-17A/F1a和IL-17A/F1b蛋白共孵育,检测巨噬细胞3、6和12 h后6种炎症相关细胞因子的m RNA表达水平变化。实验结果显示,6种炎症因子的表达量均显著上调,表明IL-17A/F1a和IL-17A/F1b可调控炎症因子的表达,对于炎症发生具有促进作用。4.利用免疫荧光技术检测显示,A.hydrophila攻毒24 h后黄河鲤头肾和肠中IL-17A/F1a和IL-17A/F1b蛋白表达量均增加,表明IL-17A/F1a和IL-17A/F1b蛋白参与了鱼体病原菌感染的免疫应答。5.构建IL-17A/F1a和IL-17A/F1b真核表达质粒,将其作为免疫增强剂注射到黄河鲤肌肉内,经检测发现其成功表达,同时免疫相关基因（CD4、CD8β、TNF-α和Ig M）的表达量显著上调。为了检测其免疫保护率,将其注射到黄河鲤肌肉内,并用A.hydrophila进行攻毒,发现黄河鲤存活率显著高于对照组。本论文分别克隆获得了黄河鲤IL-17A/F1a和IL-17A/F1b基因c DNA编码序列,对其分子特征、基因表达和免疫学响应进行了分析,对其免疫学功能进行了初步研究,结果表明,黄河鲤IL-17A/F1a和IL-17A/F1b在病原感染后免疫学响应和炎症发生中发挥重要作用。本文可为深入研究黄河鲤IL-17A/F1a和IL-17A/F1b的免疫调节分子机制提供参考依据,为IL-17A/F1a和IL-17A/F1b作为免疫增强剂在鱼类疾病防控中的应用提供理论指导。
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