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脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传性神经变性疾病,其特征是脊髓前角的α运动神经元变性,临床表现为肢体近端肌无力和肌萎缩。SMN基因是SMA的致病基因,该基因有两个结构基本相同的拷贝,分别称SMN1和SMN2,SMN1编码全长SMN(fl-SMN)蛋白,SMN2编码Δ7-SMN蛋白。研究表明,SMN1基因的功能缺陷是大多数SMA患者的发病原因,且SMA临床表型的严重程度与全长SMN蛋白的含量密切相关。患者的运动神经元表现出凋亡征象,机制不明。近来发现了一条和运动神经元凋亡特异相关的Fas通路,即Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路。不同于经典的Fas/FADD/caspase8通路,在其他类型细胞凋亡中则未发现此特异性通路。SOD1突变的肌萎缩侧索硬化(ALS)转基因鼠的运动神经元细胞对此通路表现出很高的敏感性,而对营养因子剥夺或细胞毒性反应弱。因为肌萎缩侧索硬化也系运动神经元变性疾病,故我们设想如果SMN蛋白缺乏的运动神经元对此通路敏感,我们则可以通过阻断此凋亡通路治疗SMA。在和运动神经元凋亡特异相关的Fas通路(Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS)中,Daxx是一关键因子,通过其在胞浆或胞核的转位,在细胞凋亡和转录调控中起重要作用。本研究拟利用RNAi技术抑制非SMA患者的骨髓间质干细胞SMN1基因的表达,将其诱导分化为神经元样细胞建立SMA细胞模型,并通过一系列分子生物学方法研究Daxx蛋白对SMA细胞模型凋亡的调控、并观察组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丙戊酸促进SMN的转录及表达后Daxx蛋白的亚细胞定位和变化及SMA细胞模型对Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路的敏感性。第一章RNA干扰制作SMA细胞模型目的:构建能在哺乳动物细胞中表达SMN1 shRNA的慢病毒干扰质粒,并初步探讨其对人骨髓间充质干细胞(MSCs)SMN1 mRNA及蛋白的抑制作用;应用RNAi沉默MSCs的SMN1基因建立SMA细胞模型。方法:①取非SMA病人(且无血液疾病及骨肿瘤)骨髓,分离、纯化得到骨髓间充质干细胞(MSCs)。根据Genscript公司的设计软件,设计、合成3对针对SMN基因寡聚核苷酸序列,将此DNA序列克隆至慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti中U6启动子的下游,形成能在细胞内表达SMN1特异性的短发夹状RNA的重组质粒pRNAT-SMN1,将重组质粒pRNAT-SMN1转染人骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR、Western-blot技术检测转染后MSCs的fl-SMN mRNA及SMN全长蛋白的表达;②在慢病毒载体介导下将重组质粒pRNAT-SMN1转染人骨髓间充质干细胞,经G418筛选得到能稳定表达目的shRNA的单克隆细胞系后并诱导其分化为神经元样细胞。后者通过细胞形态学观察及免疫细胞化学染色分析神经元样细胞NSE、MAP2、GFAP蛋白表达进行鉴定。再次用RT-PCR,Western-blot方法检测神经元样细胞SMN mRNA及其蛋白的表达,并与诱导前进行比较。结果:琼脂糖凝胶电泳及测序证实了重组质粒pRNAT-SMN1构建成功,转染后不同程度地抑制人骨髓间充质干细胞的fl-SMNmRNA及其蛋白的表达,mRNA水平上干扰效率为66.08%、65.15%,蛋白水平上干扰效率为58.20%、56.30%,与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。诱导后的细胞呈典型的神经元样细胞形态,免疫细胞化学染色显示细胞NSE、MAP2蛋白表达阳性,GFAP蛋白表达阴性;其fl-SMN mRNA、A7-SMN mRNA及fl-SMN蛋白表达均较诱导前增加(P＜0.05),但pRNAT-SMN1组的fl-SMN mRNA及蛋白表达仍明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);而诱导后Δ7-SMN mRNA的表达在各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:构建的pRNAT-SMN1重组质粒能有效地抑制人骨髓间充质干细胞fl-SMN mRNA及其蛋白的表达。SMN1 mRNA及其蛋白被抑制的MSCs诱导分化为神经元样细胞后可以作为SMA的细胞模型。第二章SMA细胞模型对Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路的敏感性及Daxx对其凋亡调控机制探讨1.SMA细胞模型自发性凋亡及丙戊酸干预前后Daxx蛋白的表达和亚细胞定位目的:初步研究SMA细胞模型的自发性凋亡、丙戊酸干预前后Daxx蛋白的表达及亚细胞定位,以探讨Daxx蛋白在SMA细胞模型凋亡中的作用。方法:实验以丙戊酸干预前后SMA细胞模型、正常神经元样细胞为研究对象,①绘制细胞生长曲线,观察各组细胞增殖趋势及速度;②采用噻唑兰比色实验(MTT)检测各实验组细胞的细胞活力变化;③流式细胞分析Annexin V法检测各实验组细胞凋亡情况;④免疫荧光检测Daxx蛋白的亚细胞定位;⑤共聚焦显微镜共定位fl-SMN蛋白和Daxx蛋白;⑥RT-PCR、Western-blot方法检测各组细胞Daxx mRNA及其蛋白的表达。结果:①细胞生长曲线结果显示,各组细胞数均出现2次负增殖趋势;在第2次细胞负增殖期内(在诱导结束后第4、5、6天时),不同时间点的细胞数目有统计学差异(P＜0.05);且SMA细胞模型负增殖较正常神经元样细胞明显,两者之间差异有统计学意义(P＜0.05);②MTT结果显示,各组MTT曲线均出现2次细胞活力下降趋势;在第二次细胞活力下降期,各组细胞在诱导结束后第3、4、5、6、7天时的MTT值比较差异均有统计学差异(P＜0.05),且SMA细胞模型的活力明显低于正常神经元样细胞(P＜0.05);③流式细胞分析Annexin V结果亦显示,SMA细胞模型组的细胞凋亡率较正常神经元样细胞组高(P＜0.05);VPA干预后SMA细胞模型组的细胞凋亡率明显降低(P＜0.05);④RT-PCR、Western-blot结果显示SMA细胞模型组Daxx mRNA及其蛋白的表达均高于正常神经元样细胞组(P＜0.05)。随着VPA干预的浓度增加,SMA细胞模型的fl-SMNmRNA及蛋白的表达增加;而Daxx mRNA及蛋白的表达在VPA的干预浓度由1μmol/ml加至7μmol/ml时,是逐渐降低;⑤免疫荧光检测显示,正常神经元样细胞组Daxx蛋白主要定位于细胞核,SMN蛋白定位于细胞浆和细胞核;SMA细胞模型组Daxx蛋白主要定位于细胞浆,SMN蛋白表达减少:VPA干预后Daxx蛋白主要定位于细胞核,SMN蛋白表达增加;共聚焦显微镜结果显示,fl-SMN蛋白和Daxx蛋白细胞核共定位。结论:①Daxx在SMA神经元样细胞中可能有促凋亡作用;②.fl-SMN蛋白与Daxx蛋白可能存在相互作用;③.丙戊酸促使fl-SMN转录和蛋白表达的机制可能与其抑制Daxx表达有关。2.SMA细胞模型对Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路的敏感性研究目的:研究SMN蛋白缺失神经元对Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路的敏感性。方法:以SMA细胞模型、正常神经元样细胞为研究对象研究①不同浓度抗Fas抗体(0.01,0.1,1,10,100ng/ml)处理SMA细胞模型、正常神经元样细胞24、48、72小时3个时间点,MTT比色法检测抗Fas抗体对两组细胞生长活力的影响,流式细胞仪分析细胞凋亡率;②以100ng/ml抗Fas抗体处理两组细胞后,Western-blot技术检测nNOS,Daxx,p-p38蛋白的表达;③抗Fas抗体处理SMA细胞模型与否,分别加p38抑制剂和nNOS抑制剂,流式细胞技术检测细胞凋亡率变化。结果:①随着抗Fas抗体药物浓度的增加,SMA模型组细胞活力明显下降(P＜0.05),正常神经元样细胞组细胞活力下降不明显(P＞0.05);随着时间的延长,SMA模型组细胞活力明显下降(P＜0.05),正常神经元样细胞组细胞活力下降不明显(P＞0.05)。流式细胞Annexin V分析结果显示随着抗Fas抗体药物浓度的增加,SMA模型组细胞凋亡率明显增加(P＜0.05);正常神经元样细胞组细胞凋亡率增加不明显(P＞0.05);②SMA模型组细胞在100ng/ml抗Fas抗体干预条件下,Daxx、p-p38及nNOS蛋白表达水平明显高于无干预组(P＜0.05);正常神经元样细胞100ng/ml抗Fas抗体干预与否Daxx、p-p38及nNOS蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05);③p38抑制剂SB203580和nNOS抑制剂7-NI均不但可以减少抗Fas抗体诱导的SMA细胞模型凋亡(P＜0.05),而且可以减少SMA细胞模型自发性凋亡(P＜0.05)。结论:①SMN蛋白减少或缺失可能激活Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路:②Daxx可能通过从细胞核转位到细胞浆及Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路致SMA细胞凋亡。