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营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein, VIPs)是Estruch等1996年发现的一种苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)营养期表达并分泌到培养基中的新型杀虫蛋白。Vip3A蛋白对鳞翅目(Lepidoptera)害虫具有广谱高效的杀虫活性,其氨基酸序列与已知的杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)比较,发现两者序列间没有任何的同源性,存在两种不同的杀虫机理。因此Vip3A作为一种新型的杀虫蛋白,研究Vip3A对于拓宽Bt杀虫谱,延缓昆虫抗性和基因工程改造杀虫蛋白具有重要的意义。雅安地处四川盆地西部,具有独特的生态环境和丰富的生物多样性,其土壤中的Bt菌可能蕴藏有新的营养期杀虫蛋白基因。本研究对雅安地区的金凤寺、蒙顶山、周公山和碧峰峡进行系统的Bt资源筛选及其vip3基因的鉴定研究,克隆表达出一个新的vip3/4基因,研究结果如下：在这四个地区共采集土壤样品465份,采用醋酸钠-抗生素法对士样中的Bt菌株进行分离筛选,获得765株Bt菌,土壤中的平均出菌率为164%。显微镜观察显示,分离出的Bt菌株产生的伴胞晶体形态呈现多样性,有长菱形、短菱形、方形和不定形等,充分说明雅安地区的土壤中具有丰富的Bt资源。对分离出的具有特殊晶体形态的菌株进行SDS-PAGE分析,发现这些菌株主要表达40kDa和110kDa左右的蛋白条带。利用vip3基因的通用引物Vip3s-Vip3a和V32s-V32a引物对分离出的765株Bt菌进行PCR检测,结果显示有745株菌扩增出目的条带,这四个地区Bt菌中的vip3基因检出率为97.4%,说明vip3基因在该地区的Bt菌中广泛存在。利用vip3A基因的PCR-RFLP鉴定体系,用引物vip3N2-5-vip3N2-3对含vip3基因的菌株进行鉴定,有624株菌扩增出1.486kbp的目的条带,约81.6%的菌株含vip3A基因。利用TaqI内切酶分别对它们的扩增产物进行基因型分析。结果显示603株菌PCR产物酶切后产生828bp,386bp,273bp的片段,与vip3Aa基因的酶切图谱基本一致。说明在这些地区中vip3Aa类基因最为丰富,也说明vip3A基因具有很强的保守性。另外,包括ZG151-20在内的21株菌的酶切图谱与vip3Aa1基因的PCR-RFLP酶切图谱不一样,表明这些菌株可能含有不同于vip3Aa的基因。将菌株ZG151-20的PCR鉴定产物与pEASY-T1载体连接、克隆测序Blast比对分析发现该基因片段与vip3Aal类基因具有97%的相似性,表明该基因可能为一个新型的vip3Aa类基因。用全长引物PCR方法从ZG151-20中扩增出此新型vip3A的全长基因(GenBankNO:JQ731616),被蛋白国际命名委员会正式命名为Vip3Aa48。将基因vip3Aa48连接到表达载体pET28a-c(+),获得表达载体pET-Aa48并转化到E.coli BL2。SDS-PAGE分析表明,经1mM/L的IPTG诱导后表达88.6kDa的Vip3A蛋白,诱导表达前8小时表达蛋白量维持在较高水平且上清中未检测到目的条带,蛋白主要是以包涵体的形式存在于菌体内。生物测定结果表明,Vip3Aa48蛋白对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC50为18.2μg/mL,表现出较高的杀虫活性,但对棉铃虫初孵幼虫致死作用不明显,但表现出较强的生长抑制作用。