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背景：
肾细胞癌(Renal cell carcinoma, RCC)，简称为肾癌，是最常见的肾脏恶性肿瘤类型，占肾脏恶性肿瘤的90%以上[1]。在中国，肾癌的发病率和死亡率分别居泌尿生殖系恶性肿瘤第2位和第3位，且发病率呈逐年上升趋势，年平均增长率为1.1%[2]。虽然手术可以显著延长局限性肾癌患者的存活率，但手术后仍有25-40%的患者会发生远处转移[3]。此外，在确诊肾癌时，高达20-30%的患者已存在远处转移。研究显示，肾癌患者5年总体生存率为74%，早期患者预后良好，然而转移性肾癌患者5年总体生存率下降到8%[4,5]。因此，针对肾癌的早期诊断、疾病进展监测，以及精准治疗是当前延长患者生存期亟待解决的临床问题。近年来循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)相关研究和近红外荧光染料(NIR dye)对肿瘤的定位和靶向治疗相关研究为肾癌的监测和精准治疗提供了新的契机和手段。CTCs是一类从原发灶或转移灶播散入血液循环的肿瘤细胞，越来越多的研究证明CTCs数量及CTCs分子特性与肿瘤恶性程度、药物治疗反应、患者生存期等因素关系密切。得益于分子生物及工程材料领域的迅猛发展，CTCs作为疾病进展监测及患者预后评估的手段在乳腺癌、前列腺癌、直肠癌等领域的取得重大突破。七甲川菁类染料是一类高效靶向肿瘤组织和肿瘤细胞的近红外荧光染料，其对肿瘤的特异性靶向特性为肿瘤影像学监测和抗肿瘤药物的精准递送提供了新的思路。虽然这两种手段在其他肿瘤中均有报道，但在肾癌领域，病情进展监测和预后评估主要依赖医学影像学检查，基于分子水平的评价手段尚缺乏系统性研究工作。因此，我们希望从分子水平探索CTCs和七甲川菁类染料在肾癌诊治领域中的作用。
目的：
1.筛选高效肾透明细胞癌CTCs捕获体系。
2.利用肾透明细胞癌CTCs捕获体系捕获肾透明细胞癌患者CTCs，研究肾透明细胞癌CTCs分子特性。
3.分析CTCs计数与肿瘤恶性程度之间的相关性，探讨CTCs用于评估肾癌患者预后的临床意义。
4.利用七甲川菁类NIRdye建立肾癌特异性靶向体系。
5.利用七甲川菁类NIRdye肾癌特异性靶向体系递送抗肿瘤药物，提出肾癌靶向治疗的新策略。
方法：
1.通过肾癌组织标本免疫组化和细胞捕获实验筛选高效肾透明细胞癌CTCs捕获体系。
2.利用纳米微流体芯片结合CA9和CD147抗原组合捕获肾透明细胞癌患者CTCs，制定肾癌患者CTCs鉴定标准，并利用Vimentin染色考察CTCs中EMT表型。
3.对不同临床分期肾透明细胞癌患者CTCs计数，vCTCs计数和vCTCs占CTCs百分比进行统计分析。
4.利用Mito-Tracker染料对DZ-1染料靶向肿瘤细胞位置进行示踪。
5.通过JC-1染料检测肿瘤细胞线粒体膜电位变化。同时，利用Mitostress实验评估NIRdye药物DZ-SIM对肿瘤细胞线粒体呼吸功能的影响。
6.通过半数最大抑制浓度(IC50)和凋亡实验检测NIRdye药物DZ-SIM抑制肿瘤增殖和诱导细胞凋亡的能力。
7.建立肾透明细胞癌Caki-1皮下小鼠模型，分别用DZ-1,SIM和DZ-SIM治疗12周，通过NIR成像确定药物在小鼠体内积聚部位，并绘制肿瘤生长曲线。
结果：
1.免疫组化结果显示肾癌患者组织样本中CA9和/或CD147阳性表达率高达97.1%，而EpCAM仅为18.6%。联合CA9和CD147抗原与EpCAM抗原在肾癌细胞捕获效率差异分别为Caki-1(P=0.0007)，Caki-2(P=0.0003)，769-P(P=0.0024)，786-O(P=0.0074)。
2.联合CA9和CD147抗原体系较EpCAM抗原体系在相同患者CTCs捕获效率方面提高了181%(P=0.0006)。
3.不同临床分期患者CTCs计数分别为StageⅠ期8.76±4.11个，StageⅡ期9.32±3.64个，StageⅢ期18.56±5.96个，StageⅣ期20.42±5.97个。在进展期(StageⅢ,Ⅳ)患者CTCs计数比早期(StageⅠ,Ⅱ)多1.2倍(P＜0.0001)。
4.不同临床分期患者vCTCs计数分别为StageⅠ期0.55±0.77个，StageⅡ期1.11±1.02个，StageⅢ期3.81±2.27个，StageⅣ期8.5±3.15个。vCTCs计数有显著性差异在StageⅠ期与StageⅡ期(P=0.042)，StageⅡ期与StageⅢ期(P＜0.0001)，StageⅢ期与StageⅣ期(P=0.0002)。
5.DZ-1染料与Mito-Tracker在Caki-1细胞线粒体共定位。
6.DZ-SIM组肿瘤细胞ATP产量较SIM组和DZ-1组有明显下降(P=0.0048，P＜0.0001)。DZ-SIM组线粒体膜电位较DZ-1组和SIM组有明显变化(P=0.0031，P=0.0037)。
7.NIRdye药物DZ-SIM作用Caki-1细胞、SN12C细胞、786-O细胞、ACHN细胞的IC50分别为4.8uM、7.4uM、8.4uM、10.8uM。同时，NIRdye药物DZ-SIM较DZ-1染料(P=0.0039)和SIM药物(P=0.0027)诱导细胞凋亡效果明显增强。
8.小鼠NIR成像显示DZ-1染料和NIRdye药物DZ-SIM注射后1小时，肿瘤区域有高强度信号出现，在5小时信号强度达到顶峰，且信号强度能够维持24小时。
9.与DZ-1染料和SIM药物组相比，NIRdye药物DZ-SIM治疗组显著抑制皮下肿瘤生长速度(P=0.0223，P=0.0453)。
10.小鼠NIR成像显示DZ-1染料组和NIRdye药物DZ-SIM组肿瘤组织区域信号强度较裸鼠心脏(P=0.0102，P=0.0048)、肺脏(P=0.0107，P=0.0058)、肾脏(P=0.0099，P=0.0036)、肝脏(P=0.0114，P=0.0023)和脾脏(P=0.0108，P=0.0028)有显著性差别。
结论：
1.建立以联合CA9和CD147抗原组合的肾透明细胞癌CTCs捕获体系。相对于传统EpCAM捕获手段，联合CA9和CD147抗原组合能够高效捕获肾透明细胞癌患者CTCs。
2.肾透明细胞癌患者CTCs计数与肿瘤恶性程度有关，CTCs上皮间质转变状态是区分患者临床分期的特异性标志物，有助于肾癌患者预后判断。
3.七甲川菁类NIRdyeDZ-1染料展现出特异性积聚在肾癌细胞和组织中的能力。
4.利用七甲川菁类NIRdye靶向体系将抗肿瘤药物辛伐他汀特异性递送到肿瘤细胞线粒体中并诱导细胞杀伤,NIRdye药物DZ-SIM在体内和体外都能有效地抑制肿瘤组织的生长。
肾细胞癌(Renal cell carcinoma, RCC)，简称为肾癌，是最常见的肾脏恶性肿瘤类型，占肾脏恶性肿瘤的90%以上[1]。在中国，肾癌的发病率和死亡率分别居泌尿生殖系恶性肿瘤第2位和第3位，且发病率呈逐年上升趋势，年平均增长率为1.1%[2]。虽然手术可以显著延长局限性肾癌患者的存活率，但手术后仍有25-40%的患者会发生远处转移[3]。此外，在确诊肾癌时，高达20-30%的患者已存在远处转移。研究显示，肾癌患者5年总体生存率为74%，早期患者预后良好，然而转移性肾癌患者5年总体生存率下降到8%[4,5]。因此，针对肾癌的早期诊断、疾病进展监测，以及精准治疗是当前延长患者生存期亟待解决的临床问题。近年来循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)相关研究和近红外荧光染料(NIR dye)对肿瘤的定位和靶向治疗相关研究为肾癌的监测和精准治疗提供了新的契机和手段。CTCs是一类从原发灶或转移灶播散入血液循环的肿瘤细胞，越来越多的研究证明CTCs数量及CTCs分子特性与肿瘤恶性程度、药物治疗反应、患者生存期等因素关系密切。得益于分子生物及工程材料领域的迅猛发展，CTCs作为疾病进展监测及患者预后评估的手段在乳腺癌、前列腺癌、直肠癌等领域的取得重大突破。七甲川菁类染料是一类高效靶向肿瘤组织和肿瘤细胞的近红外荧光染料，其对肿瘤的特异性靶向特性为肿瘤影像学监测和抗肿瘤药物的精准递送提供了新的思路。虽然这两种手段在其他肿瘤中均有报道，但在肾癌领域，病情进展监测和预后评估主要依赖医学影像学检查，基于分子水平的评价手段尚缺乏系统性研究工作。因此，我们希望从分子水平探索CTCs和七甲川菁类染料在肾癌诊治领域中的作用。
目的：
1.筛选高效肾透明细胞癌CTCs捕获体系。
2.利用肾透明细胞癌CTCs捕获体系捕获肾透明细胞癌患者CTCs，研究肾透明细胞癌CTCs分子特性。
3.分析CTCs计数与肿瘤恶性程度之间的相关性，探讨CTCs用于评估肾癌患者预后的临床意义。
4.利用七甲川菁类NIRdye建立肾癌特异性靶向体系。
5.利用七甲川菁类NIRdye肾癌特异性靶向体系递送抗肿瘤药物，提出肾癌靶向治疗的新策略。
方法：
1.通过肾癌组织标本免疫组化和细胞捕获实验筛选高效肾透明细胞癌CTCs捕获体系。
2.利用纳米微流体芯片结合CA9和CD147抗原组合捕获肾透明细胞癌患者CTCs，制定肾癌患者CTCs鉴定标准，并利用Vimentin染色考察CTCs中EMT表型。
3.对不同临床分期肾透明细胞癌患者CTCs计数，vCTCs计数和vCTCs占CTCs百分比进行统计分析。
4.利用Mito-Tracker染料对DZ-1染料靶向肿瘤细胞位置进行示踪。
5.通过JC-1染料检测肿瘤细胞线粒体膜电位变化。同时，利用Mitostress实验评估NIRdye药物DZ-SIM对肿瘤细胞线粒体呼吸功能的影响。
6.通过半数最大抑制浓度(IC50)和凋亡实验检测NIRdye药物DZ-SIM抑制肿瘤增殖和诱导细胞凋亡的能力。
7.建立肾透明细胞癌Caki-1皮下小鼠模型，分别用DZ-1,SIM和DZ-SIM治疗12周，通过NIR成像确定药物在小鼠体内积聚部位，并绘制肿瘤生长曲线。
结果：
1.免疫组化结果显示肾癌患者组织样本中CA9和/或CD147阳性表达率高达97.1%，而EpCAM仅为18.6%。联合CA9和CD147抗原与EpCAM抗原在肾癌细胞捕获效率差异分别为Caki-1(P=0.0007)，Caki-2(P=0.0003)，769-P(P=0.0024)，786-O(P=0.0074)。
2.联合CA9和CD147抗原体系较EpCAM抗原体系在相同患者CTCs捕获效率方面提高了181%(P=0.0006)。
3.不同临床分期患者CTCs计数分别为StageⅠ期8.76±4.11个，StageⅡ期9.32±3.64个，StageⅢ期18.56±5.96个，StageⅣ期20.42±5.97个。在进展期(StageⅢ,Ⅳ)患者CTCs计数比早期(StageⅠ,Ⅱ)多1.2倍(P＜0.0001)。
4.不同临床分期患者vCTCs计数分别为StageⅠ期0.55±0.77个，StageⅡ期1.11±1.02个，StageⅢ期3.81±2.27个，StageⅣ期8.5±3.15个。vCTCs计数有显著性差异在StageⅠ期与StageⅡ期(P=0.042)，StageⅡ期与StageⅢ期(P＜0.0001)，StageⅢ期与StageⅣ期(P=0.0002)。
5.DZ-1染料与Mito-Tracker在Caki-1细胞线粒体共定位。
6.DZ-SIM组肿瘤细胞ATP产量较SIM组和DZ-1组有明显下降(P=0.0048，P＜0.0001)。DZ-SIM组线粒体膜电位较DZ-1组和SIM组有明显变化(P=0.0031，P=0.0037)。
7.NIRdye药物DZ-SIM作用Caki-1细胞、SN12C细胞、786-O细胞、ACHN细胞的IC50分别为4.8uM、7.4uM、8.4uM、10.8uM。同时，NIRdye药物DZ-SIM较DZ-1染料(P=0.0039)和SIM药物(P=0.0027)诱导细胞凋亡效果明显增强。
8.小鼠NIR成像显示DZ-1染料和NIRdye药物DZ-SIM注射后1小时，肿瘤区域有高强度信号出现，在5小时信号强度达到顶峰，且信号强度能够维持24小时。
9.与DZ-1染料和SIM药物组相比，NIRdye药物DZ-SIM治疗组显著抑制皮下肿瘤生长速度(P=0.0223，P=0.0453)。
10.小鼠NIR成像显示DZ-1染料组和NIRdye药物DZ-SIM组肿瘤组织区域信号强度较裸鼠心脏(P=0.0102，P=0.0048)、肺脏(P=0.0107，P=0.0058)、肾脏(P=0.0099，P=0.0036)、肝脏(P=0.0114，P=0.0023)和脾脏(P=0.0108，P=0.0028)有显著性差别。
结论：
1.建立以联合CA9和CD147抗原组合的肾透明细胞癌CTCs捕获体系。相对于传统EpCAM捕获手段，联合CA9和CD147抗原组合能够高效捕获肾透明细胞癌患者CTCs。
2.肾透明细胞癌患者CTCs计数与肿瘤恶性程度有关，CTCs上皮间质转变状态是区分患者临床分期的特异性标志物，有助于肾癌患者预后判断。
3.七甲川菁类NIRdyeDZ-1染料展现出特异性积聚在肾癌细胞和组织中的能力。
4.利用七甲川菁类NIRdye靶向体系将抗肿瘤药物辛伐他汀特异性递送到肿瘤细胞线粒体中并诱导细胞杀伤,NIRdye药物DZ-SIM在体内和体外都能有效地抑制肿瘤组织的生长。