研究背景慢性心力衰竭(CHF)的防治一直是国内外心血管领域中基础和临床研究的重点,上世纪90年代中期开始认识到导致CHF的共同的病理生理基础是心肌重构,因此CHF的治疗策略也从过去增加心肌收缩力为主,转变为目前以防止心肌重构为主的生物学治疗模式。心肌重构是CHF患者发病率和死亡率的重要决定因素,且与病因无关,临床已经证实凡能逆转心肌重构的治疗手段都能改善CHF患者预后、降低死亡率。心肌重构是一种自身不断发展的过程,与肾素-血管紧张素系统(RAS)关系最为密切,尤其是心脏局部的RAS,其病理意义远远大于循环RAS。传统观念认为血管紧张素转换酶(ACE)是RAS的枢纽,其催化产物血管紧张素II(AngII)是RAS最关键的效应因子。2000年,Donoghue等首先发现ACE的同源物,命名为ACE2,ACE2的主要生物学效应是降解AngII产生Ang1-7。与AngII的效应相反,Ang1-7具有舒张血管、抗增生、抗炎症的作用,能抑制和逆转心肌重构,对衰竭心脏有保护效应。心脏不仅是RAS的重要靶器官,而且是合成RAS的重要场所,已经证实心肌组织可以自身合成RAS的大部分成员。多年来,ACE和AngII一直占据了RAS的核心地位,普遍公认RAS的激活在心肌重构和CHF的发生发展过程中扮演了“不光彩”的角色。但随着ACE2和Ang1-7的发现,打破了传统的RAS格局,人们发现RAS不仅促成心肌重构,而且还具有抑制心肌重构的双重效应,即:通过AngII使血管收缩、细胞增殖;通过Ang1-7使血管舒张、拮抗细胞增殖。这主要归因于功能效应相反的一对酶(ACE和ACE2)。本课题从临床患者、动物模型和心肌细胞培养三个层面进行研究,并给予相应的药物干预,探讨CHF时ACE/ACE2相互负向调节与CHF心功能、心肌重构的关系,并观察ACEI和β-受体阻滞剂的治疗意义。研究方法1.选取CHF患者和正常人,RT-PCR和Western Blot检测心肌组织ACE、ACE2 mRNA和蛋白表达;HE染色检测心肌病理改变;免疫组化检测心肌组织ACE、ACE2蛋白表达及定位;Masson三色染色检测心肌组织胶原沉积。2.建立心肌梗死后CHF大鼠模型,分为假术组、CHF对照组、苯钠普利组、卡维地洛组和联合用药组(同时给予苯那普利和卡维地洛)。8周后检测:⑴大鼠血流动力学指标;⑵体重及左心室重量指数(LVMI);⑶循环和心肌组织AngII水平;⑷RT-PCR和Western Blot检测心肌组织ACE、ACE2 mRNA和蛋白表达;⑸心肌组织HE染色;(6)免疫组化检测心肌组织ACE、ACE2蛋白表达及定位;⑺心肌组织Masson三色染色检测胶原沉积。⑻心肌组织电镜观察。3.培养乳鼠心肌细胞,分为正常组、AngII刺激组和Ang1-7刺激组。检测:⑴心肌细胞直径和表面积;⑵RT-PCR和Western Blot检测心肌细胞ACE、ACE2 mRNA和蛋白表达;⑶激光共聚焦显微镜观察心肌细胞ACE和ACE2蛋白表达部位。结果1.与正常对照组比较,CHF患者ACE2和ACE mRNA和蛋白表达均明显升高,中重度CHF患者(NYHA III-Ⅳ级)升高更为显著。轻度CHF患者(NYHA II级)ACE/ACE2 mRNA和蛋白比值降低,而中重度CHF患者ACE/ACE2 mRNA和蛋白比值升高。2.HE染色可见衰竭心肌组织的心肌细胞排列紊乱,早期心肌细胞代偿性肥大,晚期出现局灶性坏死,间质胶原结缔组织增生,纤维化,瘢痕形成,可见炎性细胞浸润。3.免疫组化染色可见ACE和ACE2蛋白主要表达在心肌细胞、血管内皮细胞等部位,衰竭心肌阳性染色较正常心肌明显增多。4.正常心肌组织胶原阳性染色很少,衰竭心肌组织胶原阳性染色明显增多,不仅位于血管周围,而且心肌细胞间质胶原沉积明显增多。5.苯钠普利组、卡维地洛组和联合用药组大鼠的血流动力学参数较CHF对照组有所改善,+dp/dtmax和-dp/dtmin绝对值、LVSP均高于CHF对照组,而LVEDP则低于CHF对照组。苯钠普利组和卡维地洛组血流动力学参数没有显著差异。6.CHF模型组大鼠的LVMI较假术组显著升高,苯钠普利组和联合用药组LVMI较CHF对照组明显降低,而卡维地洛组与CHF对照组比较无显著差异。7.苯钠普利和联合用药组大鼠循环和心肌组织AngII水平较CHF对照组降低,卡维地洛对循环AngII水平没有影响,但能降低心肌组织的AngII水平。8.苯钠普利、卡维地洛和联合用药这三个治疗组大鼠心肌组织ACE mRNA和蛋白表达较CHF对照组显著降低,其中联合用药组具有部分叠加效应。三个治疗组的ACE2 mRNA和蛋白表达均高于CHF对照组。9.衰竭心肌电镜观察见线粒体肿胀,嵴断裂,内质网扩张,心肌间质水肿,灶性肌原纤维断裂、溶解,心肌细胞之间连接疏松。10.AngII刺激组心肌细胞无论直径还是表面积均显著增加,Ang1-7对培养心肌细胞直径和表面积没有影响。11.与正常心肌细胞比较,AngII刺激组和Ang1-7刺激组ACE mRNA和蛋白表达无明显变化。AngII刺激组ACE2 mRNA和蛋白表达明显降低,Ang1-7刺激组ACE2 mRNA和蛋白表达显著升高。12.激光共聚焦显微镜观察见ACE和ACE2蛋白表达部位限于心肌细胞膜,心肌细胞胞浆和胞核无表达。结论1.人和大鼠衰竭心肌组织出现心肌重构病理表现和心肌组织局部RAS激活,表现为心肌AngII含量增加、ACE、ACE2基因和蛋白表达增强,但ACE上调更显著,ACE/ACE2比值升高。2.CHF患者心肌组织ACE、ACE2基因和蛋白水平升高,与心功能分级呈正比。3.苯钠普利和卡维地洛均能改善CHF大鼠心功能,联合用药具有叠加效应。苯钠普利减轻心肌重构,卡维地洛改善心肌重构的作用尚需长期观察。4.苯钠普利和卡维地洛均可下调衰竭心肌ACE表达,刺激ACE2表达增强,ACE/ACE2比值下降,其意义在于抑制AngII产生,促进AngII降解,这是对上述两种药物作用机制的新解释。5.AngII可诱导心肌细胞肥大,抑制心肌细胞ACE2基因和蛋白表达,对ACE表达没有影响。6.Ang1-7对心肌细胞形态没有影响,对心肌细胞ACE2基因和蛋白表达有增强作用,不影响ACE表达。