目的 尽管人角膜内皮细胞(huaman corneal endothelial cells，HCECs)在体外能够被成功的培养和生长，但正常情况下，在体内却不能发生增殖，当面临衰老、疾病和手术等损伤时，角膜内皮细胞密度(endothelial cell derlsity，ECD)会逐渐下降，一旦发生功能失代偿，多需依靠穿透性角膜移植(penetratingkeratoplasty，PK)来解决，但移植术后仍然存在ECD超生理性下降的问题，并且这己成为导致远期角膜移植失败的最主要原因。有观点认为，器官功能恶化与该器官中关键的组织细胞老化有关，移植物失功也与移植器官组织的加速衰老有关。因此，对正常HCECs衰老的研究显得十分重要。ECD和角膜内皮细胞体外培养的增殖能力均随着年龄下降，说明HCECs在体内可能发生衰老。研究认为，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKI)基因，是几个重要的衰老相关基因，在细胞衰老的过程中发挥重要的作用，但在正常HCECs衰老发生过程中的作用尚未见有相关研究。 基于此，本研究对不同年龄HCECs中p16、p21、p<27KIP1>和p53等的表达情况进行了检测，以揭示正常HCECs衰老过程中起重要作用的关键效应物。 方法 1．实验材料：收集临床上DX液保存的行角膜移植手术后剩余的周边角膜环状组织，记录供体年龄。切取部分组织经台盼蓝-茜素红双染法，观察角膜内皮细胞的活性；并行石蜡切片HE组织学染色，保证角膜材料组织结构的正常。 2．各衰老相关基因表达的定性检测：对18、33、54、68岁的正常角膜环行冰冻切片后进行免疫组化检测，以及对不同年龄段(20、30、40、50、60岁，共5组，每组含相同或相近年龄的3～4个角膜环)的角膜，每组获取单一的角膜内皮细胞，提取总RNA，行RT-PCR检测。 3．各衰老相关基因表达的定量分析：将20、24、26、30、50、55、56、60岁八组(每组含相同或相近年龄的2～4个角膜环)正常人角膜内皮细胞提取总RNA，行实时荧光定量PCR检测，观察p16、p21、p27和p53基因随年龄的表达情况。分为两组，≤30岁为年轻组，≥50岁为老年组，利用非配对t检验对两组差别进行统计学分析。 4．衰老细胞的观察：采用中性衰老相关β-半乳糖苷酶(senescenceassociated β-galactosidase，SA-β-GAL)细胞化学染色方法，对不同年龄(9、17、23、57、65、67岁)角膜内皮细胞染色的情况进行观察。 结果 术后即刻台盼蓝-茜素红双染显示角膜内皮细胞的平均细胞密度为(2391.4±84.6)个/mm<2>，活性率为(84.4±5.3)％。HE染色结果示角膜上皮、基质和内皮各层结构完整，排列规则。冰冻切片的免疫组化结果可见p16、p21、p27和p53等各衰老相关基因在角膜内皮细胞中均有表达，且阳性表达位于细胞核内。对各年龄段正常HCECs行RT-PCR检测，结果显示p16、p21、p27和p53各衰老相关基因的目的条带存在，表达阳性。荧光实时定量PCR检测显示各年龄段四种基因表达量强弱不等，p16的表达在老年组大于年轻组(t=3.402，P=0.014)，p21、p27和p53两组表达没有统计学差异。SA-β-GAL染色显示年轻者没有或者偶见呈现蓝染的阳性细胞，且染色较浅，老年者则阳性细胞多见，且染色较深。 结论 1．体内HCECs随年龄增长会发生衰老改变，各年龄段HCECs中均有CDKI基因的表达，且p16的相对表达量随年龄增加而增高，其介导的衰老通路可能在正常HCECs衰老的过程中发挥着重要作用。 2．本研究为进一步探讨角膜内皮细胞疾病或慢性角膜植片失功发生的机制提供了全新的思路，并可能为寻找增加角膜内皮细胞密度的方法，有效防治慢性植片失功的发生探索出新的途径。