海带蓝光受体及相关基因的研究

来源 :中国科学院研究生院(海洋研究所) | 被引量 : 1次 | 上传用户:xue19830821
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本研究中运用四种不用的方法提取海带孢子体RNA,通过对比分析,确定了采用CTAB提取液[2% (w/v) CTAB,100 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 50 mM EDTA, pH 7.5, 2 M NaCl, 50 mM DTT]提取RNA的方法,该方法的主要改进之处: (1)高浓度(50 mM)的DTT作为防止多酚氧化的还原剂加入提取液中;(2) 1/4体积的乙醇和1/9体积的3 M醋酸钾(pH 4.8)用来沉淀去除多糖;(3) 1/10倍体积的3 mol/L醋酸钠(pH 5.0)和两倍体积的乙醇选择性沉淀RNA;(4) -80℃沉淀30 min沉淀RNA。CTAB改进法提取的海带孢子体RNA质量好(A260/280 =1.96±0.05),产量高(68μg/g),分离的RNA可用于RT-PCR反应,扩增相关基因片段。该方法提取海带配子体RNA效果也很好。根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、铁线蕨(Adiantum capillus-veneris)、转板藻(Mougeotia scalaris)和无隔藻(Vaucheria frigida)等的蓝光受体蛋白保守序列,设计一系列简并引物,进行RT-PCR扩增,筛选并克隆测序了4条序列片段,通过比对分析,所得序列与已知的蓝光受体基因序列不一致。在所获得的序列中,一条783 bp的序列与肌醇-1-磷酸合成酶基因的片段有较高的相似性,通过RACE法克隆出该基因的3’末端,5’末端克隆没有成功,全长序列有待深入分析。
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