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目的:探究中药活性成分淫羊藿苷、姜黄素和胡椒碱小复方(简称ICP)对B6;129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe,tau P301L)1Lfa/J转基因AD模型小鼠病理进程的延缓作用,并从线粒体能量代谢环节研究该中药复方延阻AD病程的机制,为中药活性成分干预AD病理演进提供实验参考。方法:设置野生型和稳定表达APP695 Swedish突变基因的小鼠神经胶质瘤Neuro-2A细胞培养组以及N2asw细胞ICP药物处理组(N2a、N2asw、N2asw+ICP);常规饲养基因背景相同的B6129SF2/J正常小鼠(NTg)、3x Tg AD小鼠(Tg)和ICP药物处理病理小鼠(Tg+ICP),并建立相对应的新生鼠大脑神经元培养。运用细胞免疫荧光染色、免疫印迹、线粒体分离制备、ATP与ROS水平检测、ELISA检测、免疫共沉淀、水迷宫等技术,从分子、细胞及动物整体水平系统研究正常组、对照组及用药组在Aβ、tau及线粒体能量代谢相关通路分子标记、功能和学习记忆行为学等方面的差异,评价药物处理对这些差异的转归作用,探索中药药物延缓AD病程的线粒体能量代谢相关机制。1、参照文献报道进行淫羊藿苷、姜黄素、胡椒碱配方,分别应用N2asw细胞和3x Tg AD小鼠原代神经元进行CCK-8实验,筛选适当的ICP小复方。2、用筛选出的中药小复方ICP,分别处理N2asw细胞、Tg神经元,并与平行设置的正常组和AD病理对照组细胞进行比较。在药物作用后,检测ATP、ROS及乳酸脱氢酶LDH活性的水平变化;观察记录细胞形态、神经纤维丝中线粒体分布及其与其它蛋白质标记物共定位关系等;免疫印迹技术检测BACE1、tau、Ptau S396及GSK-3β等常规AD病理标记,线粒体丙酮酸脱氢酶PDHE1α与分裂蛋白Drp1,突触PSD95等相关蛋白质的表达变化。分析病理细胞与正常细胞之间的显著差异,评价药物对AD病理改变的转归作用,并探究其相关的线粒体机制。此外,在N2a/N2asw细胞中初步探索了线粒体分裂蛋白Drp1与Ptau396之间的相互作用。3、设置NTg、Tg和Tg+ICP三个实验动物组,每组各10只雌性小鼠。制备含有淫羊藿苷、姜黄素和胡椒碱的含药饲料(简称ICP饲料),连续喂养2月龄Tg小鼠6个月至8月龄。水迷宫实验检测月龄适配Tg组和Tg+ICP组小鼠逃潜伏期和靶象限滞留时间,评价ICP对3x Tg小鼠学习记忆损伤的改善作用。取8月龄Tg+ICP小鼠大脑组织,分别制备皮层和海马组织蛋白匀浆或提取线粒体,检测相关AD病理和线粒体分子标记的表达变化,测定ATP水平,与月龄适配NTg、Tg对照组小鼠进行比较,分析ICP对AD病理小鼠脑组织线粒体能量代谢抑制的改善作用,及其与Aβ清除、减缓tau蛋白磷酸化以及AD学习记忆损伤修复的关联。结果:1、N2a/N2asw细胞系实验结果显示,淫羊藿苷、姜黄素、胡椒碱配方浓度为80:8:4u M、处理细胞24h,设为后续实验所用配方ICP浓度及处理时间上限。ELISA方法测定揭示ICP处理可以有效逆转N2asw细胞中人源Aβ1-42水平和ROS的升高(P<0.05,P<0.01)、ATP含量下降(P<0.01)。蛋白质共定位研究揭示N2asw细胞中线粒体PDHE1α表达减少和分布异常,该异常与Aβ上升、Ptau S396增多和PSD95减少密切相关;ICP处理使N2asw细胞PDHE1α表达与分布趋向正常,并伴随各项AD病理标记物的转归。蛋白印迹分析表明,ICP处理明显抑制N2asw细胞中BACE1、Ptau S396、GSK3β、线粒体分裂蛋白Drp1等异常升高、逆转线粒体PDHE1α、突触PSD95蛋白表达水平的下降,具有统计学显著意义。该药物转归作用,在药物处理的时间-效应关系研究中亦得到印证。此外,用免疫共沉淀实验结果显示,N2asw细胞中线粒体Drp1与磷酸化tau蛋白之间存在相互作用,ICP处理可减少这种相互作用2、原代神经元细胞实验结果进一步印证N2a/N2asw细胞系实验结果。CCK-8实验筛选出适宜的淫羊藿苷、姜黄素、胡椒碱配方浓度为20:1:0.5u M。对NTg、Tg和Tg+ICP组神经元之间的比较结果显示,正常与AD病理细胞之间ATP、ROS、Aβ1-42的水平变化与LDH活性差异具有统计学显著性(P<0.05或P<0.01),ICP处理可以有效逆转;蛋白免疫印迹证实各蛋白标记物的变化趋势均相同于N2a/N2asw细胞系中观察结果。Tg神经元神经纤维丝生长较NTg神经元明显减少、变短,神经纤维丝中PDHE1α与Aβ1-42、Ptau S396和突触相关蛋白PSD95的共定位结果证实,AD病理引起线粒体的减少、分布异常及碎片化与Aβ异常聚集、Ptau S396增多和PSD95减少直接相关,经ICP处理后,病理神经元神经纤维丝中PDHE1α表达与线粒体分布连续性趋向正常,伴随各项AD病理标记物的转归。3、比较8月龄Tg和Tg+ICP小鼠的水迷宫实验数据显示,随着定位航行训练天数递增,用药组小鼠逃避潜伏期缩短程度高于对照组,其空间探索实验中靶象限停留时间亦有上升,但未见统计学显著性。对NTg、Tg和Tg+ICP各组小鼠大脑海马、皮层中AD病理相关蛋白及线粒体相关蛋白的免疫印迹的检测揭示:正常组和病理对照组之间,或者对照组和用药组之间的变化趋势与前述体外细胞实验结果相似。结论:小复方ICP对AD病理所致线粒体能量代谢抑制及分裂-融合动力学失衡具有修复作用,并有效减轻Aβ异常聚集、tau蛋白磷酸化水平下降、及突触标记物水平下降,促进线粒体分布与功能正常化和促进神经纤维丝生长,对3x Tg AD模型小鼠具有一定学习记忆能力修复作用。ICP可抑制N2asw细胞中Drp1与磷酸化tau蛋白的相互作用,则为研究线粒体生物转运及功能修复与AD病理进程延缓之间的相关性提供新的研究视野。