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目的:随着人们生活方式和的膳食结构的改变,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)在世界范围内已成为最常见的慢性肝病之一,NAFLD疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)/肝纤维化、NASH相关肝硬化及肝细胞癌。非酒精性脂肪性肝纤维化是NAFLD进展过程中的重要病理阶段,约有20％-40％NASH患者进展为肝纤维化或肝硬化。因此,寻求防治非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化的有效策略为目前研究的热点。机体免疫参与多种慢性肝脏炎症及肝纤维化的发生发展,Toll样受体(tolllikereceptor,TLR)是天然免疫系统中识别病原微生物的主要受体,尤以TLR4的作用最受关注,TLR4活化后通过激活核因子κB抑制物激酶-β(inhibitorofnuclearfactor-κBkinase-β,IKK-β)/核因子(nuclearfactor-κB,NF-κB)促进炎症因子和纤维化因子的分泌,导致肝脏炎症及纤维化。我们前期研究表明,过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferators-activatedreceptors,PPARγ)激动剂能够有效延缓非酒精性脂肪性肝纤维化的进展。本实验以蛋氨酸-胆碱缺乏(methionineandcholinedeficient,MCD)饮食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型,以PPAR激动剂和抑制剂进行干预实验,旨在探明靶向调控PPARγ表达对非酒精性脂肪性肝纤维化肝组织TLR4/NF-(k)B信号通路的作用及其机制,为临床有效防治非酒精性脂肪性肝纤维化提供新的策略及科学依据。
方法:选用健康雄性C75BL/6J小鼠,采用胆碱-蛋氨酸缺乏饮食(MCD)8周建立小鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型(MCD组),分别以PPARγ激动剂吡格列酮(MCD+PIO组)及抑制剂GW9662(MCD+GW组)进行干预实验,并以胆碱-蛋氨酸充足饮食设立对照组(Control)。
1、实验动物一般情况观察:实验过程中观察小鼠一般情况,如进食情况、活动力、毛发及体重变化等,造模结束时称取小鼠体重及肝湿重,计算肝指数(肝湿重/体重×100％)。
2、血清生化学指标检测:丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST),采用全自动生化分析仪、酶法测定。
3、肝组织病理学观察:HE、Masson染色观察肝脏脂肪变、炎症活动及纤维化程度。
4、肝组织相关基因检测:采用实时定量RT-PCR和Westernblot检测PPARγ、TLR4、IKK-β和NF-κBmRNA及蛋白的表达。
5、统计学分析:实验数据采用SPSS13.0进行统计学处理,多组间比较采用单因素方差分析,各组间比较采用LSD-t,P＜0.05为差异有统计学意义。
结果:
1、实验动物一般情况:Control组小鼠进食正常、活泼、毛发有光泽;MCD组及MCD+GW组小鼠进食逐渐减少,精神萎靡,少动,毛发紊乱,无光泽,体重及肝指数较对照组明显降低;MCD+PIO组小鼠一般情况较MCD组小鼠明显改善。
2、实验小鼠血清生化学改变:MCD组小鼠ALT及AST较Control组显著升高(431.12±35.17U/L比32.97±3.31U/L及423.85±28.02U/L比33.82±3.68U/L,P值＜0.05);MCD+PIO组ALT及AST较MCD组显著降低(321.98±39.69U/L比431.12±35.17U/L及330.30±43.99U/L比423.85±28.02U/L,P值均＜0.05),而MCD+GW组ALT及AST水平高于MCD组(705.55±28.90U/L比431.12±35.17U/L及663.57±29.59U/L比423.85±28.02U/L,P均值＜0.05)。
3、肝组织病理学改变:Control组小鼠肝小叶结构正常,肝板排列整齐,MCD组肝细胞呈中至重度脂肪变,以腺泡Ⅲ带为著,伴点灶状肝细胞坏死及炎细胞浸润,汇管区纤维组织增生及窦周纤维化(NAS评分7～8S2～3)。MCD+PIO组小鼠肝脂肪变、炎症及纤维化程度较MCD组明显减轻(NAS评分5～6S1～2),而MCD+GW组小鼠肝组织损伤程度较MCD组加重(NAS评分7～8S3～4)
4、肝组织PPARγ、TLR4、IKK-β及NF-κBmRNA表达变化:MCD组PPARγmRNA较Control组明显降低(P＜0.05),TLR4、IKK-β及NF-κBmRNA显著升高,mRNA表达量(拷贝)分别为:0.54±0.06比0.96±0.05、4.60±0.02比1.01±0.06、3.59±0.54比1.01±0.03及4.62±0.28比0.99±0.01(P值均0.05);与MCD组相比,MCD+PIO组随着PPARγmRNA表达上调,TLR4、IKK-β及NF-κBmRNA表达下调,mRNA表达量(拷贝)分别为:0.74±0.02、2.42±0.10、1.34±0.51及2.42±0.50(P值均＜0.05);而MCD+GW组PPARγmRNA表达明显受抑制,TLR4、IKK-β及NF-κBmRNA表达则显著增强,mRNA表达量(拷贝)分别为:0.23±0.02、7.17±0.16、6.61±0.27及7.66±0.35,与MCD组及MCD+PIO组相比P值均＜0.05。
5、肝组织PPARγ、TLR4、mK-β及NF-κB蛋白表达变化:MCD组PPARγ蛋白较Control组明显降低,TLR4、IKK-β及NF-κBmRNA及蛋白显著升高,蛋白相对表达量分别为:0.81±0.04比1.58±0.09、1.17±0.04比0.44±0.02、1.06±0.07比0.43±0.05及1.04±0.02比0.44±0.05(P值均＜0.05);与MCD相比,MCD+PIO组随着PPARγ蛋白表达上调,TLR4、IKK-β及NF-κB蛋白表达下调,蛋白相对表达量分别为:1.07±0.09、0.76±0.01、0.71±0.08及0.70±0.05(P值均＜0.05);而MCD+GW组PPARγ蛋白表达明显受抑制,TLR4、IKK-β及NF-κB蛋白表达则显著增强,蛋白相对表达量分别为:0.53±0.10、1.64±0.03、1.76±0.26及1.84±0.10,与MCD组及MCD+PIO组相比P值均＜0.05。
结论:
1、肝组织TLR4、IKK-β及NF-κB表达异常为MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝纤维化的重要发病机制。
2、靶向调控PPARγ可通过调控TLR4/NF-κB通路及相关基因表达阻止或延缓非酒精性脂肪性肝纤维化的发生与进展。