论文部分内容阅读
背景结直肠肿瘤是人类常见的恶性肿瘤肿瘤之一,其发病率和死亡率居男性恶性肿瘤第三位与第四位,居女性恶性肿瘤的第二位与第三位。美国人群中结直肠癌发病率居于第三位,死亡率位居第二位。2015年我国结、直肠癌新发病例37.63万,死亡19.1万,其发病率和死亡率在我国大多数地区排名均为第5位。对于仅存在原位结直肠癌的患者为5年生存率可达90%,然而伴有远处转移患者5年生存率仅为13%。结直肠癌最常见的转移部位为肝脏,约15%~20%的患者在首次诊断时就伴有肝脏转移。超过半数的患者最终发展为肝脏转移,肝脏转移是结直肠癌患者最常见的死亡原因。外科手术目前仍是唯一的治愈手段,完整切除结直肠癌肝脏转移病灶的患者5年生存率为35~40%。不可行肝脏切除的患者,五年生存率仅为1%,总生存期(overall survival,OS)为30个月。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil Gelatinase-associated Lipocalin,NGAL)是载脂蛋白(Lipocalin)家族的新成员,近年来研究发现NGAL可以通过调节基质金属蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)活性、铁元素转运以及上皮—间质转化参与肿瘤细胞的增殖、局部浸润与远处转移。越来越多的研究证实NGAL在食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等多种消化系统恶性肿瘤中异常表达,参与肿瘤的发生发展。目前,国内有关NGAL与结直肠癌发生发展的研究有限,需要进一步探讨。本研究采用商品化载体TK负载NGAL siRNA转染结肠癌细胞,检测NGAL m RNA和蛋白质的水平,阐明NGAL基因表达对于结肠癌细胞迁移、凋亡及增殖的关系,为RNAi用于晚期结直肠恶性肿瘤的治疗提供依据。目的探讨siRNA干扰NGAL基因沉默作用对结肠癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。为以NGAL为目的基因采用RNAi技术治疗晚期结直肠癌提供依据。方法采用转染试剂盒ribo FECT?CP Transfection Kit(TK)负载NGAL siRNA转染结肠癌细胞株HT-29(TK组),以未转染的HT-29细胞为对照组。实时定量PCR和ELISA分别检测细胞NGAL m RNA水平和细胞培养上清液中NGAL蛋白水平,采用细胞划痕实验、Promega Cell Proliferation Assay G3580和BD C6流式细胞仪分别检测细胞迁移、增殖和凋亡情况。结果HT-29细胞转染NGAL siRNA 72 h后,TK组NGAL m RNA水平为对照组的0.123(p﹤0.05);转染48 h后,TK组细胞培养上清液中NGAL蛋白为(0.328±0.055)μg/L,低于对照组的(1.071±0.143)μg/L(t=8.205,p=0.001)。转染48 h后,TK组凋亡率为(18.87±1.65)%,低于对照组的(11.93±1.90)%(t=-4.752,p=0.009)。转染24 h后,TK组细胞迁移率为对照组的(23.35±6.35)%(t=11.930 p<0.01)。转染48 h后,TK组细胞增殖率为对照组的(90.00±5.30)%(t=1.983,p=0.118)。结论NGAL siRNA可以在m RNA和蛋白水平抑制结肠癌细胞NGAL基因的表达,抑制细胞迁移,促进细胞凋亡,对细胞增殖作用不明显,RNAi可能用于晚期结直肠癌的治疗。