Ang-(1-7)对TGF-β1和CTGF诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响

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目的:探讨血管紧张素-(1-7) [Ang-(1-7)]对转化生长因-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)诱导大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)细胞增殖和细胞外基质分泌的影响。方法:将GMCs传代培养后按以下分组加入不同干预因素,Ang-(1-7)终浓度为10-6mol/L,TGF-β1终浓度为5ng/ml,CTGF为终浓度5ng/ml。①对照组:GMCs培养液中不加入干预因素;②Ang-(1-7)组:GMCs培养液中加入Ang-(1-7);③TGF-β1组:GMCs培养液中加入TGF-β1;④TGF-β1+Ang- (1-7)组:GMCs培养液中加入TGF-β1及Ang-(1-7);⑤CTGF组:GMCs培养液中加入CTGF;⑥CTGF +Ang- (1-7)组:GMCs培养液中加入CTGF及Ang-(1-7)。(1)采用WST-1法检测肾小球系膜细胞数目:传代培养的GMCs用无血清的DMEM培养液制成5×104/ml的细胞悬液,接种于96孔板中,每孔加入细胞悬液100μl,无血清培养24h后按上述分组加入药物,干预24h后,每孔加入WST-1 10μl,37℃继续孵育4h,在酶联免疫检测仪450nm波长处测定吸光光度(OD)值,OD值越大代表细胞数目越多;(2)RT-PCR法检测层粘蛋白(LN)mRNA和Ⅳ型胶原(ColⅣ) mRNA表达:实验分组及药物干预浓度同上,药物干预48h后,按RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA,逆转录为cDNA后进行PCR反应。PCR反应结束后取产物15μl于1.5%琼脂糖凝胶中以0.5×TBE作为电泳缓冲液,100V电压电泳40min,用凝胶成像扫描分析系统,测定各组目的基因与内参基因的光密度比值。(3)放射免疫法检测细胞培养上清液中LN和ColⅣ的含量,观察GMCs细胞外基质分泌情况:实验分组及药物干预浓度同上,按实验分组加入不同药物干预48h后,用放射免疫法检测细胞培养上清液中LN和ColⅣ的含量。实验结果用均数±标准差( x±s)表示,多组均数间比较采用单因素方差分析,以P<0.05表示有统计学意义。采用SPSS14.0软件进行统计学分析。结果:(1)TGF-β1和CTGF明显诱导GMCs增殖(P<0.05);Ang-(1-7)可明显抑制基础状态下的GMCs增殖(P<0.05);同时Ang-(1-7)对TGF-β1和CTGF诱导的系膜细胞增殖有显著的抑制作用(P<0.05);(2)检测LNmRNA、ColⅣmRNA表达:与对照组相比,TGF-β1和CTGF可明显上调GMCs LNmRNA、ColⅣmRNA表达(P<0.05);Ang-(1-7)明显下调基础状态下GMCs LNmRNA、ColⅣmRNA的表达(P <0.05) ; Ang-(1-7)对TGF-β1和CTGF诱导的LNmRNA、ColⅣmRNA的表达均有明显的抑制作用(P<0.05)。(3)细胞外基质成分层粘蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)的含量:细胞上清液细胞外基质成分LN、ColⅣ含量在TGF-β1组较对照组明显升高(P<0.05),Ang-(1-7)组上述指标均低于对照组(P<0.05),同时Ang-(1-7)对TGF-β1和CTGF的促细胞外基质LN、ColⅣ分泌也有显著的抑制作用(P<0.05)。结论:①Ang-(1-7)能抑制基础状态下及TGF-β1、CTGF诱导的GMCs增殖。②Ang-(1-7)可下调基础状态下及TGF-β1、CTGF诱导的GMCs LN、ColⅣmRNA的表达。③Ang-(1-7)减少基础状态下及TGF-β1、CTGF诱导的GMCs细胞外基质LN、ColⅣ的分泌。
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