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百合（Lilium spp.）是世界著名的鲜切花,在国内外花卉产业中占有重要地位。在种球繁殖及鲜切花生产过程中,百合易受到真菌、病毒、细菌等多种病原菌的危害。目前发现的百合病害达几十种之多,其中由镰刀属（Fusarium spp.）真菌引起的枯萎病是百合生产中危害最严重的病害。WRKY转录因子是植物特有的超基因家族,在调节植物发育、胁迫反应和激素信号转导中起着重要作用。在这项研究中,从一种对枯萎病具有高度抗性的野生百合岷江百合（Lilium regale Wilson）中发现了42个WRKY基因。根据系统发育分析将这些Lr WRKY进行分类并对其进行基因组结构分析。利用定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR,q RT-PCR）分析Lr WRKY基因在岷江百合中的表达模式。此外,克隆了响应信号分子水杨酸（salicylic acid,SA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,Me JA）、乙烯（ethylene,ET）和过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）处理和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.lilii）侵染的百合抗病相关基因Lr WRKY2,并分析了其功能。总之,本研究提供了关于Lr WRKY基因的结构和功能特性的有价值的信息,这不仅加深了我们对岷江百合抵抗尖孢镰刀菌的分子机制的了解,而且为后续的岷江百合WRKY基因克隆、功能解析及在岷江百合抗逆境胁迫中的转录调控机制研究奠定了基础。本论文的研究工作及得到的主要结果如下:1.利用逆转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）获得了42个岷江百合WRKY的全长c DNA序列,WRKY转录因子中有三种保守模体,分别是保守Motif 1、2和3。聚类分析结果表明,岷江百合WRKY成员分为三大类:I、II和III类,其中大多数都属于II类,根据WRKY DNA结合结构域的进化关系,将岷江百合II类中的WRKY蛋白进一步分为五个亚类,即IIa、IIb、IIc、IId和IIe,其中大多数为IIc类。基因结构分析结果表明除Lr WRKY3外,其他WRKY基因的外显子数目分布在2～4之间,内含子数目在1～3之间。2.qRT-PCR分析表明,正常生长状态下多数岷江百合WRKY成员在根中的表达量较高,在叶、茎和花中的偏低。SA、Me JA、ET和H2O2四种信号分子处理抑制了Lr WRKY27、28、36和40的表达,上调了Lr WRKY1、2、3等14个基因的表达。在尖孢镰刀菌侵染抗病岷江百合后,WRKY基因的转录水平各不相同,但Lr WRKY2等7个基因的表达量均被尖孢镰刀菌侵染显著诱导。3.构建LrWRKY2基因的亚细胞定位重组载体,转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105中,侵染洋葱表皮细胞经过暗培养后,于激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白,Lr WRKY2-GFP融合基因表达的绿色荧光特异性地分布在洋葱表皮细胞核中,表明Lr WRKY2是位于细胞核中的蛋白质。4.通过凝胶阻滞实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）体外分析原核表达获得的Lr WRKY2重组蛋白与启动子PLr PR10-5结合的特性。将重组p ET-32a-Lr WRKY2质粒转化到原核表达菌株（Escherichia coli）BL21（DE3）中,在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG）终浓度1 m M,温度为28℃条件下诱导6 h,获得包涵体目的蛋白,对包涵体蛋白进行变性、纯化、复性、浓缩后获得符合EMSA所需要求的目的蛋白。同时合成含有W-box的探针以及W-box核心序列发生突变的探针,并进行生物素标记。重组蛋白与探针结合反应结果表明Lr WRKY2蛋白特异性结合W-box。5.利用酵母单杂交系统对岷江百合转录因子LrWRKY2的转录激活活性进行了初步分析。分别将PLr PR10-5与Lr WRKY2基因序列插入到p Bait-Ab Ai诱饵载体和p GADT7猎物载体中,将重组猎物载体p GADT7-Lr WRKY2通过PEG/醋酸锂转化法转化到含有p Ab Ai-PLr PR10-5重组诱饵载体的酵母感受态细胞Y1HGold中,并在选择性培养基—SD/-Leu培养基（含200 ng/m L Ab A）上划线培养。结果显示Lr WRKY2可以特异性结合PLr PR10-5基因的启动子序列并激活PLr PR10-5的转录。6.将LrWRKY2转入烟草中超表达,成功获得稳定表达的T2代阳性植株。q RT-PCR结果表明,Lr WRKY2在转基因烟草中稳定且过量表达,并且Lr WRKY2的过量表达提高了转基因烟草中部分防卫相关基因的表达。选取Lr WRKY2表达量较高的4个株系的转基因烟草进行对尖孢镰刀菌的抗性实验,结果表明转基因烟草对尖孢镰刀菌侵染的抵抗能力大大强于野生型烟草（wild type,WT）。综上所述,本研究成功获得了岷江百合WRKY基因家族成员（Lr WRKY1～Lr WRKY42）。q RT-PCR结果表明WRKY基因在岷江百合正常生长状态下的表达量具有根组织优势,此外,WRKY基因家族成员响应几种信号分子的处理,并且响应尖孢镰刀菌的侵染。其中Lr WRKY2响应SA、Me JA、ET和H2O2信号分子的处理,同时表达受尖孢镰刀菌侵染显著诱导。亚细胞定位分析表明Lr WRKY2是位于细胞核中的蛋白质,原核表达Lr WRKY2重组蛋白特异性结合W-box。此外,酵母单杂交分析结果显示Lr WRKY2可以特异性结合PLr PR10-5基因的启动子序列并激活PLr PR10-5的转录。最后,Lr WRKY2在烟草中稳定超表达提高了转基因烟草中部分防卫相关基因的表达,且增强了转基因烟草对尖孢镰刀菌的抗性。