VCP(Valosin-ContainingProtein)是Ⅱ型AAA-ATP酶，其含量非常丰富，序列高度保守，广泛参与了膜融合、异常折叠蛋白或短寿蛋白的降解、基因表达调控、细胞周期、细胞凋亡等一系列细胞过程。研究表明所有这些活动都直接或间接的与泛素-蛋白酶体通路(Ubiquitin-ProteasomePathwayUPP)有关。VCP蛋白主要是作为分子伴侣参与UPP通路。泛素-蛋白酶体通路是ATP依赖性的非溶酶体蛋白降解途径，能高效、高选择性的降解细胞内蛋白质，发挥着重要的蛋白质质量控制作用(qualitycontrol)。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的性状。目前对转基因植物的研究主要集中在抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等方面，对转基因植物的蛋白降解机制研究很少。本文通过合成VCP抗原多肽以制备多克隆抗体，在国内外首次探讨了转基因枸杞中VCP的表达情况，为进一步研究转基因植物中蛋白质降解规律奠定了基础。 实验目的：通过生物信息学技术分析VCP蛋白的同源性，预测并设计VCP的抗原表位，采用固相多肽合成技术合成VCP多肽，免疫BALB/c小鼠制备VCP的多克隆抗体并进行鉴定，利用该抗体检测正常枸杞愈伤组织和转基因枸杞愈伤组织中VCP的表达情况。 实验方法： 1、利用蛋白质分析软件VectorNTI9.0对VCP进行一般性质、同源性、亲疏水性分析，构建进化树。利用互联网公共数据库及软件http：//psort.nibb.ac.jp/form2.html分析蛋白的亚细胞定位，利用http：//www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict.html及http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.p1进行屈曲性、可及性、转角结构等二级结构分析，利用http：//immunax.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.p1对抗原性进行分析，综合上述分析结果，设计了VCP的抗原表位。 2、多肽的合成及偶联：利用固相多肽合成技术合成VCP多肽，将其与载体蛋白KLH偶联合成VCP-KLH。 3、多克隆抗体的制备及检测：利用常规免疫方案用VCP-KLH免疫BALB/c小鼠，制备VCP的多克隆抗体，利用ELISA技术检测其效价，Westernblot检测其特异性。 4、枸杞愈伤组织VCP的表达情况：利用免疫组织化学方法对正常枸杞愈伤组织和转基因枸杞愈伤组织中VCP的表达情况进行检测。 结果： VCP序列高度保守，哺乳动物间同源性达到99.5％，根据蛋白质的同源性和抗原性，兼顾亲水性、屈曲性、可及性及转角结构，选取了位于641-651位和693-700位的两段表位序列，融合形成19个氨基酸作为抗原多肽片断。固相多肽合成法合成了多肽，高效液相色谱法(HPLC)显示多肽纯度达到75.23％，ELISA技术检测抗体效价〉1：100000，Westernblot检测抗体可与正常枸杞愈伤组织和转基因枸杞愈伤组织中的VCP相结合。免疫组织化学检查显示正常枸杞愈伤组织中VCP呈弥散云雾状着色，转基因枸杞愈伤组织中呈棕黄色颗粒状着色。经统计学分析，有显著性差异(P＜0.05)。 结论： 1、VCP蛋白序列高度保守，哺乳动物间同源性达到99.5％。 2、利用蛋白质分析软件和互联网资源对VCP的抗原表位进行预测是可行的。表位序列GRLDQLIYIPLEICQRACK可用于制备VCP蛋白的多肽抗体。 3、利用VCP-KLH制备了VCP的多克隆抗体，本试验所制备的多克隆抗体可用于Westernblot及免疫组织化学检测。 4、转基因枸杞愈伤组织中VCP的表达上调。