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第一部分结直肠癌组织中PRDX2与血管生成拟态的表达及临床意义目的:探讨结直肠癌组织中PRDX2与血管生成拟态及相关因子的表达及其临床意义。方法:1.免疫组织化学法检测70例结直肠癌组织及癌旁正常组织PRDX2与VM相关因子VEGFR2、MMP-2、LN-5γ2蛋白的表达,统计学分析PRDX2与VEGFR2、MMP-2、LN-5γ2蛋白表达的相关性。2.统计学分析PRDX2、VEGFR2、MMP-2及LN-5γ2蛋白表达与患者临床病理特征之间的相关性。3.CD34/PAS免疫组化双重染色法检测70例结直肠癌组织VM的表达,统计学分析VM形成与PRDX2蛋白表达的相关性。结果:1.PRDX2、VEGFR2、MMP-2及LN-5γ2蛋白表达在结直肠癌组织中的表达显著的高于癌旁正常组织(P<0.05);PRDX2蛋白表达与VEGFR2、MMP-2及LN-5γ2蛋白表达成正相关(P<0.05)。2.PRDX2、VEGFR2、MMP-2及LN-5γ2蛋白的表达与结直肠癌的临床TNM分期及淋巴结转移有相关(P<0.05);MMP-2和LN-5γ2蛋白的表达与肿瘤分化程度有相关(P<0.05),PRDX2和VEGFR2蛋白的表达与肿瘤分化程度无明显相关(P>0.05);PRDX2、VEGFR2、MMP-2及LN-5γ2蛋白表达与患者的年龄、性别和肿瘤大小程度均无明显相关(P>0.05)。3.70例患者的结直肠癌组织中16例VM阳性表达,VM阳性表达率为22.86%(16/70),PRDX2蛋白表达与VM表达成正相关(P<0.05)。结论:结直肠癌组织中PRDX2与VM相关因子VEGFR2、MMP-2及LN-5γ2蛋白表达高于癌旁正常组织,且PRDX2与VM相关因子蛋白表达间有相关性;PRDX2、VEGFR2、MMP-2及LN-5γ2蛋白表达与结肠癌患者不良的临床病理特征有相关性;结直肠癌组织中PRDX2蛋白表达与VM的形成有关。第二部分结直肠癌细胞中PRDX2对血管生成拟态的影响及其意义目的:研究PRDX2对结直肠癌细胞VM形成的影响及其意义。方法:1.采用细胞体外三维培养检测结肠癌细胞VM形成能力。2.PRDX2干扰慢病毒及阴性对照慢病毒分别转染HCT116细胞后,使用Real-Time PCR和WB检测PRDX2 m RNA和蛋白表达的干扰效果。3.外源性VEGF诱导以模拟肿瘤微环境,细胞体外三维培养检测PRDX2干扰慢病毒组及阴性对照组HCT116细胞VM形成变化情况。4.外源性VEGF诱导后采用Transwell小室迁移及侵袭实验检测PRDX2干扰慢病毒组及阴性对照组HCT116细胞迁移及侵袭变化情况。5.使用Real-Time PCR及WB法检测干扰PRDX2后对HCT116细胞VM形成相关因子表达的影响。6.使用裸鼠皮下移植瘤模型,观察干扰PRDX2后HCT116细胞皮下移植瘤生长变化情况;使用裸鼠肺转移瘤模型,观察干扰PRDX2后HCT116细胞肺转移变化情况。结果:1.与人脐静脉内皮细胞HUVEC对照比较,三株人结肠癌细胞株中只有分化程度较低的HCT116细胞株能够形成VM管样结构。2.同阴性对照组、亲本空白对照组分别比较,PRDX2干扰组HCT116细胞PRDX2 m RNA和蛋白表达的水平均明显下降(P<0.05)。3.VEGF诱导后HCT116细胞VM形成能力增强(P<0.05);PRDX2干扰后HCT116细胞VM的形成能力明显下降(P<0.05)。4.VEGF诱导后HCT116细胞迁移及侵袭能力增强(P<0.05);PRDX2干扰后HCT116细胞迁移及侵袭明显下降(P<0.05)。5.干扰PRDX2后HCT116细胞VEGFR2蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);p-VEGFR2蛋白表达水平随着VEGF诱导时间均逐渐增高,PRDX2干扰后p-VEGFR2蛋白表达水平与相应的对照组比较明显降低(P<0.05)。VEGF诱导后MMP-2、MMP-9及LN-5γ2的m RNA及蛋白的表达水平增强(P<0.05),PRDX2干扰慢病毒组MMP-2、MMP-9及LN-5γ2的m RNA及蛋白表达水平与相应阴性对照组比较明显减弱(P<0.05)。6.PRDX2干扰后裸鼠皮下移植瘤平均体积(0.82±0.11cm3)和肺转移瘤的数目(27.13±3.55个)分别低于阴性对照组皮下移植瘤平均体积(1.43±0.17 cm3)和肺转移瘤的数目(43.62±5.81个)(P<0.05),干扰PRDX2能抑制结肠癌细胞生长与转移。结论:PRDX2能促进结直肠癌细胞的VM形成,结直肠癌细胞迁移、侵袭力随之增强,进而增强了结直肠癌细胞的生长与转移能力。第三部分PRDX2通过ERK1/2通路调控结直肠癌血管生成拟态的机制研究目的:研究ERK1/2通路在PRDX2调控结直肠癌细胞VM形成中的作用及机制。方法:1.外源性VEGF诱导,使用WB检测干扰PRDX2对HCT116细胞中ERK1/2与p-ERK1/2蛋白表达变化情况的影响。2.使用ERK1/2通路抑制剂PD98059干预,外源性VEGF诱导后细胞体外三维培养检测HCT116细胞VM形成变化情况。3.使用ERK1/2通路抑制剂PD98059干预,外源性VEGF诱导,使用Transwell小室迁移实验、侵袭实验,检测HCT116细胞迁移及侵袭力变化情况。4.使用Real-Time PCR及WB法,检测ERK1/2通路抑制剂PD98059干预后HCT116细胞VM相关的因子m RNA及蛋白表达的变化情况。5.使用免疫组化法检测动物皮下移植瘤中干扰PRDX2后VM形成相关因子MMP-2、MMP-9及LN-5γ2蛋白表达的变化情况。结果:1.干扰PRDX2后HCT116细胞中ERK1/2蛋白的表达水平无明显变异(P>0.05);p-ERK1/2蛋白表达水平随着VEGF诱导时间均逐渐增高,PRDX2干扰后p-ERK1/2蛋白表达水平较阴性对照组比较明显降低(P<0.05),PRDX2对结直肠癌VM形成的调控可能与ERK1/2通路有关。2.ERK1/2通路抑制剂PD98059干预后,与相应阴性对照组比较,HCT116细胞后VM的形成能力明显的减弱(P<0.05)。3.ERK1/2通路抑制剂PD98059干预后,与相应阴性对照组比较,HCT116后细胞迁移及侵袭力明显的减弱(P<0.05)。4.ERK1/2通路抑制剂PD98059干预后,与相应阴性对照组比较,VM形成相关因子MMP-2、MMP-9及LN-5γ2的m RNA及蛋白表达明显的减弱(P<0.05)。5.干扰PRDX2后裸鼠皮下移植瘤组织中PRDX2、MMP-2、MMP-9及LN-5γ2的表达与对照组相比较明显减弱(P<0.05)。结论:PRDX2可能通过激活ERK1/2通路促进结直肠癌VM形成;干扰PRDX2能抑制结直肠癌ERK1/2通路激活,降低VM形成相关因子的表达,从而抑制VM形成及结直癌细胞的生长与转移。