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丝氨酸蛋白酶是一类以重要的蛋白水解酶,它是以丝氨酸为活性中心的,在生物有机体中起着十分重要的生理作用,它们通过激活或者抑制蛋白酶原而起到调节因子作用。本文研究的蛋白酶K属丝氨酸蛋白酶类,它是林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Kerantin)为唯一碳氮源的环境中生长,故将其称作蛋白酶K。蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性,能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键,常被用于降解蛋白生产短肽。它具有丝氨酸蛋白酶类所具有的典型催化三联体Asp39-His69-Ser224特征并且活性中心周围有两个Ca2+结合位点以增加其稳定性,使其在更广泛的条件下保持较高的酶活力。蛋白酶K能将蛋白失活或降解,利用其这个特性,在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K都有着重要的应用。因此,研究和探索蛋白酶K的性质,功能以及应用,对其发展现状进行展望是进一步开发利用这种高效酶的前提。本文主要对蛋白酶K进行优化重组,重点对重组蛋白酶K的培养条件优化,其酶学性质的研究。本实验是对原始蛋白酶K基因进行密码子优化,然后进行全基因合成。将合成的蛋白酶K基因连接到载体pPIC9K上,组成pPIC9K-proteinase k重组质粒,然后将线性化的pPIC9K-proteinase k重组质粒导入GS115感受态细胞中,筛选出带多拷贝目的基因的菌株,作为实验菌株,称为GS11-pPIC9K-proteinase k。本文还研究了温度、起始PH、诱导时间和诱导时机四个方面对重组蛋白酶K菌株生长和蛋白表达的影响,得到重组蛋白酶K的最优培养条件为:重组蛋白酶K经过BMGY培养基中培养到OD600到达2.0的时候将其离心,菌体沉淀重悬于BMMY培养基中培养72,隔24h添加0.5%(v/v)甲醇。文章还对重组蛋白酶K进行了镍柱分离纯化,最后的纯化产品生物活性为12.94U/mg,纯度为93.3%,总回收率为45.4%,蛋白酶k的纯度从69.4%增加到91.6%。通过纯化,1L发酵液中产生105毫克蛋白酶k,酶活为1100U。蛋白酶k上清酶活回收率为68.9%。并且研究了重组蛋白酶K的酶学性质,实验证明其有很好的温度耐受性和一定的酸碱耐受性,这些结论都证明重组蛋白酶K是一个可以广泛被应用的蛋白酶。