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目的:建立应用酶联免疫斑点(Enzyme Linked- immunospot Assay,ELISPOT)技术检测结核菌感染的方法,初步研制酶联免疫斑点试剂盒(简称自制试剂盒),并评价其在结核病诊断临床中的应用价值。方法:选择30例非结核感染志愿者,26例结核病人和4例结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验强阳性、无任何结核病临床症状且相关检查结果无异常的志愿者,用英国Oxford Immunotec公司研制的T SPOT-TB试剂盒(简称T SPOT-TB试剂盒)检验。根据结核杆菌特异的效应T淋巴细胞在特异抗原的刺激下分泌γ-干扰素(IFN-γ),检测IFN-γ可以确定体内是否存在对结核杆菌反应的效应T淋巴细胞的原理,建立应用ELISPOT技术检测结核菌感染的方法。预先用IFN-γ单克隆抗体包被96孔硝酸纤维素膜板,用密度-梯度离心法分离被检测者外周血单核细胞,加入96孔板中,用特异性重组ESAT-6蛋白和CFP10-ESAT6融合蛋白刺激,活化细胞,结核杆菌特异的效应T淋巴细胞将分泌IFN-γ,然后加入生物素标记的IFN-γ多克隆抗体作为检测抗体,再加入碱性磷酸酶(AKP)标记的链亲和素,加入底物BCIP/NBT溶液显色,在板底形成肉眼可见的深蓝色斑点。每一个斑点代表一个分泌IFN-γ的T淋巴细胞。根据体内是否存在结核杆菌效应T淋巴细胞,对结核杆菌感染进行辅助诊断。改变不同的实验条件确定应用ELISPOT技术检测结核杆菌感染方法的最佳细胞浓度、孵育时间,蛋白浓度等,初步研制自制ELISPOT试剂盒。选择32例非结核感染志愿者和31例结核病人,均使用T SPOT-TB试剂盒和自制试剂盒进行检验。将两者检测结果进行对比。结果:用T SPOT-TB试剂盒进行检验,30例结核感染者的血样本检测结果93.3%(28/30)阳性,6.7%(2/30)阴性,30例非结核感染者检测结果96.6%(29/30)阴性,3.4%(1/30)阳性。改变不同的实验条件来确定自制试剂盒的各个合适的实验条件,结果表明:2×105细胞密度较为合适,孵育时间20h为实验条件,刺激结核致敏T淋巴细胞的蛋白浓度20μg/ml为实验条件。用T SPOT-TB试剂盒和自制试剂盒对32例非结核感染者和31例结核病人进行检测,结果92.1%(58/63)T SPOT-TB试剂盒与自制试剂盒检测结果相同,7.9%(5/63)结果不同。对两种试剂盒检出结果行χ2检验,两者差异无显著性(P>0.05),说明两种试剂盒对血样阳性检出率没有显著性差异。31例已确诊结核病人检测结果为:T SPOT-TB试剂盒87.1%(27/31)阳性,自制试剂盒90.3%(28/31)阳性。32例非结核感染者检测结果为:T SPOT-TB试剂盒18.8%(6/32)阳性,自制试剂盒25.0%(8/32)阳性。自制试剂盒的敏感性略高于T SPOT-TB试剂盒。自制试剂盒的假阳性率高于后者,但因所选病历中包括消化系统和血液肿瘤患者,以及老年人等免疫低下者,不排除其为结核潜伏感染者,因机体免疫力低下,对PPD实验无反应。故尚需进一步的追踪阳性病例是否发病。自制试剂盒痰菌阳性组检测孔内斑点数显著高于痰菌阴性组检测孔(P<0.05),说明痰菌阳性患者体内特异性IFN-γ分泌细胞数有不同程度提高。结论:英国Oxford Immunotec公司研制的T SPOT-TB试剂盒诊断结核病感染者的敏感度和特异性均较高;本研究建立了一种结核病细胞免疫诊断试剂盒,其诊断结核病感染者的敏感性和特异性与T SPOT-TB试剂盒相似,且操作简便,花费小;ELISPOT在检测结核潜伏感染者敏感性和特异性均高于PPD皮肤试验。