流感病毒(Influenza virus,IFV)的爆发给人类的健康和生命造成了严重危害,时常出现的致病性禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)感染同样会给人类带来致命性威胁,给世界各国带来极大的恐慌。在流感病毒的生命周期中,神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)负责催化水解宿主细胞表面唾液酸与流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)之间的糖苷键,使成熟的病毒从被感染的细胞表面释放出来从而继续感染其它细胞。另外,NA裂解完子代病毒粒子的HA与宿主细胞之间连接的唾液酸残基后还要行使另外两种重要功能:①阻止子代病毒粒子从宿主细胞释放后发生凝聚;②裂解呼吸道黏膜中的唾液酸,从而阻止子代病毒颗粒灭活,加速流感病毒在呼吸道中的传播,因此,NA是抗流感病毒药物设计的理想靶点。环己烯类NA抑制剂(Neuraminidase inhibitors,NAIs)磷酸奥司他韦具有高效、低毒、生物利用度高的优点,是目前唯一的口服NAI。但是由于流感病毒固有的高变异性,快速出现的耐药株(如N1-H274Y和N2-E119V突变株)严重削弱了该药物的防治作用。目前,抗流感病毒药物在临床使用中面临的最大障碍是耐药性问题,因此,研发新型、高效和抗耐药性NAIs已成为抗流感病毒领域的主要方向之一。从NAs的进化关系上看,可分成几个不同的组:group-1 NAs,其中包含N1、N4、N5和N8亚型,group-2 NAs,其中包含N2、N3、N6、N7和N9亚型。N10和N11亚型被认为是NA样蛋白,这是由于它们缺乏正常唾液酸酶活性,从而形成一个独特的组,可以暂时命名为第三组(group-3)。NAs的X射线晶体学研究表明,在group-1 NAs中,催化中心附近存在开放的150-loop和150-cavity,催化中心通过150-loop与150-cavity连通,而在group-2 NAs中150-loop和150-cavity始终是闭合的。尽管H1Nlpdm09NA(09N1)属于group-1 NAs,但晶体结构研究显示它的150-loop是闭合的,它也不具有开放的150-cavity。该研究表明晶体状态下09N1的150-loop不同于group-1 NAs,而与group-2 NAs相似。但是,最近研究表明,09N1和group-2 NAs的150-loop和150-cavity在一定条件下也可以呈开放状态。此外,与NA催化中心紧邻的还有一个430-loop,催化中心通过它与430-cavity连通。晶体学结构显示430-loop与150-loop相邻,从构成二者的氨基酸残基上看,二者有一定程度的重叠,这就直接导致两个loop之间存在构象或功能的相互影响。由于靠近催化中心而使150-cavity和430-cavity对开发新的抗流感病毒药物具有十分重要的作用。因此,深入理解催化中心、150-loop和430-loop的关系,可以为设计新型、同时靶向两个或三个位点的抗流感病毒药物提供新策略。本论文针对现有神经氨酸酶抑制剂的不足,通过对奥司他韦与神经氨酸酶NAs复合物结构生物学信息的分析,运用多位点结合策略,对奥司他韦进行基于靶标结构和多样性导向的结构优化,从而发现新型高活性尤其是在抗耐药性方面有所突破的抗流感病毒候选药物。研究工作分为以下几方面:靶向于神经氨酸酶催化中心和150-cavity的双位点结合型奥司他韦衍生物的设计、合成与活性研究。本部分以课题组前期发现的N1选择性抑制剂和其它报道的N2选择性抑制剂为先导化合物,以NAs的催化中心和150-cavity为药物设计的靶点,运用多位点结合思路设计并合成了 11个新型的奥司他韦衍生物。在抑酶活性实验中,I-3b和I-3c强烈抑制group-1和-2 NAs,对09N1、N2、N6和N9亚型的抑制活性分别是奥司他韦羧酸(OSC)的6.8-12.5倍和1.2-3.9倍。它们对N1-H274Y和N2-E119V的抑制活性也优于OSC,并且抑制B型流感病毒NA的能力与OSC相当;在细胞水平的抗病毒活性实验中,它们抑制H5N1、H5N2、H5N6和H5N8毒株的活性优于OSC。此外,I-3b抑制H1N1和H3N2株的活性也与OSC相当。I-3b在体内(鸡胚)中的抗禽流感病毒(H5N2)活性也优于OSC。同时,I-3b显示出较高的代谢稳定性和较低的体内外毒性。分子动力学研究阐明了I-3b对group-1和-2 NAs具有强效抑制活性的原因。总之,该研究首次以新合成的活性化合物验证了 09N1和group-2 NAs的150-1oop和150-cavity可以被诱导打开的猜想,发现了一个具有研究前景的候选药物I-3b,为进一步通过靶向催化中心和150-cavity来发现高效、高选择性和抗耐药性的NAIs提供了重要思路。特异性抑制group-1 NAs和N1-H274Y耐药株的奥司他韦衍生物的发现。在上一部分研究的基础上,为进一步探讨150-cavity作为结构修饰位点的化学空间及发现具有高效抗耐药性的新型奥司他韦衍生物,本部分继续以奥司他韦为母核结构,同时参考早期发现的化合物58和59的特征,运用基于生物电子等排、分子杂合等策略设计并合成了五小类共25个靶向NAs的催化中心和150-cavity的N-取代奥司他韦衍生物,并测试了其在细胞水平的抗病毒活性和抑酶活性。结果发现,化合物Ⅱ-15h在细胞水平抑制H1N1、H5N1、H5N2、H5N6和H5N8毒株的活性优于OSC或与之相当。此外,在抑酶活性实验中,Ⅱ-15h对N1、N8和N1-H274Y的抑制活性是OSC的5-86倍。特别地,Ⅱ-15h能够强烈抑制09N1亚型,该发现再次证实09N1的150-1oop更倾向于以开放的形式存在。在体内(鸡胚)抗禽流感病毒活性评价中,Ⅱ-15h抗H5N2的活性优于OSC。分子动力学模拟为Ⅱ-15h对group-1和N1-H274Y突变型NAs的强抑制活性提供了合理的解释。此外,Ⅱ-15h具有较低的体内急性毒性和较高的代谢稳定性,尽管其口服生物利用度有待提高,但仍不失为具有进一步研究潜力的先导化合物。其它取代类型的双位点结合型奥司他韦衍生物的设计、合成与活性研究。在第二章和第三章化合物结构的基础上,本部分运用多位点结合策略,设计并合成了包含多样性取代基类型的双位点结合型奥司他韦衍生物,取代基涵盖取代苄基、取代或未取代的芳杂环、取代或未取代的苯丙烯基、酰基和磺酰基等。细胞水平的活性测试表明,化合物的C-5位氨基取代基上如含有较强吸电子基团,对活性不利;C-5位取代基含有酰胺和磺酰胺基团的衍生物抗禽流感病毒活性很低;与之形成对比的是,如含有狭长共轭结构的苯丙烯基则可能有利于与150-cavity结合,从而表现出较强的抗group-1 NAs亚型禽流感病毒活性和抑酶活性,甚至达到与OSC相当的水平。此外,大部分含有C-5位氨基联芳杂环的OSC衍生物选择性抑制禽流感病毒及其对应的group-1 NAs,甚至达到了与OSC相当的水平。总体来看,本章活性化合物的抑酶活性与细胞水平的抗禽流感病毒的活性趋势基本一致,并得到分子模拟的验证。“三位点结合型”奥司他韦衍生物的设计、合成与活性研究。本部分根据上述双位点结合型神经氨酸酶抑制剂的成功经验,依据神经氨酸酶的结构特征与430-cavity的适配性要求,采用分子杂合等药物设计策略,在奥司他韦的C-1位羧基和C-5位氨基位点同时进行修饰,设计合成了一系列(20个)同时靶向催化中心、150-cavity和43 0-cavity的“三位点结合型”奥司他韦衍生物。通过抑酶活性测试发现,此系列化合物,如IV-9e,对禽流感病毒NAs的抑制能力显著下降,而在本章中作为对比的双位点结合型化合物IV-1le抑制野生型N1和突变型N1-H274Y的活性分别是OSC的1.5和1.8倍;IV-lle在细胞水平上的抗H5N1活性也优于OSC,且体内外毒性较低。总之,尽管本研究未发现活性突出的三位点结合型NAIs,但获得的构效关系为新一轮设计多位点结合型神经氨酸酶抑制剂提供了参考。综上所述,本论文针对现有流感病毒神经氨酸酶抑制剂的耐药性问题,在对奥司他韦与靶标结合模式分析的基础上,充分利用NAs催化中心、150-cavity和430-cavity的结构特征、与配体结合的适配性要求以及group-1和-2神经氨酸酶的结构差异性,运用多位点结合、片段杂合等策略,保持奥司他韦母核不变,分别在其C-1位羧基和(或)C-5位氨基进行多样性的修饰,设计合成了五类双位点结合型和一类三位点结合型奥司他韦衍生物。通过抑酶活性、细胞水平及动物(鸡胚)水平的抗病毒活性评价,发现多个具有高活性、高选择性、抗耐药的先导化合物。特别是,化合物I-3b在细胞水平抑制H5N1、H5N2、H5N6和H5N8毒株的活性及在体内(鸡胚)抑制抗禽流感病毒(H5N2)的活性均优于奥司他韦;II-15h在细胞水平抑制H1N1、H5N1、H5N2、H5N6和H5N8毒株的活性优于奥司他韦或与之相当,抑制N1、N8和N1-H274Y酶活的能力是OSC的5-86倍;在进一步的初步成药性评价中,发现I-3b和II-15h均具有较高的代谢稳定性和较低的体内外毒性,是具有广阔开发前景的候选药物。此外,本研究还首次通过小分子化合物验证了 09N1和group-2 NAs的150-loop和150-cavity可以诱导打开的猜想,为以后基于靶标结构发现高活性、高选择性和抗耐药性的神经氨酸酶抑制剂奠定了坚实的基础。