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用于核酸适配体筛选的SELEX技术已经有二十年的历史,但是目前得到广泛应用的只是少数经典的适配体。导致这种现象的主要原因首先是核酸适配体筛选的难度大,其次是很多得到的核酸适配体没有经过详细的表征。近年来发现DNAG-四链体(G4)与氯化高铁血红素(hemin)形成的复合物具有过氧化物酶性质,因而被广泛用于分析检测中。但是关于G4/hemin过氧化物酶的一些基础酶学性质却鲜有报道。因此本文主要围绕核酸适配体的筛选表征,以及G4/hemin的酶学性质展开,主要内容如下:
1.利用我们研究组建立的核酸适配体筛选平台,分别成功筛选到了能特异性结合L-色氨酸和L-酪氨酸的核酸适配体,分别命名为Trp3a-1和Y-1。通过比较全面的表征,发现Trp3a-1形成发卡(hairpin)二级结构,其中环部(1oop)进一步形成反平行G4结构。Trp3a-1与L-色氨酸主要通过空间互补和疏水相互作用力结合,其中L-色氨酸主要与Trp3a-1的G4结合;Y-1主要通过形状互补和静电作用与L-酪氨酸结合。通过在Trp3a-1的5’末端修饰生物素,将其固定于链霉亲和素包被的葡聚糖微球上,并制成微型色谱柱,以该色谱柱实现了对D/L-色氨酸的手性拆分。
2.在本研究组建立的G4结构和过氧化物酶活力的构效关系基础上,以辣根过氧化物酶(HRP)为对比,进一步探讨了G4/hemin过氧化物酶的作用机理、失活机理、底物特异性等酶学性质。研究结果显示:G4/hemin过氧化物酶的失活主要源于hemin的降解,其最大失活速率常数比辣根过氧化物酶高一个数量级,其γ是HRP的1/24,并且G4/hemin过氧化物酶的底物范围比HRP更加广泛。由于hemin通过π-π堆积结合于G4的末端,其活性中心的裸露是导致以上现象的主要原因。通过合理的实验设计,探讨了过氧化反应中间体的产生和降解过程。以所观察到的实验现象为基础,结合有关过氧化物酶的文献,推导了G4/hemin过氧化物酶的可能催化/失活机理。
3.比较了G4和鲱鱼精DNA、小牛胸腺DNA和一个由33碱基组成的单链DNA库在溶液中的稳定性。结果显示两个正平行G4比其他序列稳定。考察了L-色氨酸和维C钠对DNA稳定性的影响,结果显示L-色氨酸和维C钠在磷酸缓冲液抑制DNA氧化损伤,L-色氨酸在水中促进DNA氧化损伤。