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本实验采用SfaMNPV诱导的SL-1细胞的凋亡,研究了SL-1细胞凋亡的特征,检测了SL-1细胞中是否存在核酸内切酶G(EndonucleaseG),初步探究了昆虫细胞中是否存在起源于线粒体的非caspase依赖性的凋亡途径。主要结果如下:
(1)SfaMNPV诱导SL-1细胞出现了典型的凋亡特征SfaMNPV能在Tn-581细胞中有效增值,测得病毒滴度为2.41X10<7>pfu/ml。SfaMNPV诱导SL-1细胞产生了典型细胞凋亡特征。病毒处理细胞8-16h在光镜下可见细胞膜表面突出或形成小泡,细胞形成了大量的凋亡小体;24h后,细胞几乎全部破裂成凋亡小体。DAPI荧光染色显示感染细胞核逐渐变形,直至破裂成小块而被凋亡小体包裹。凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型凋亡细胞DNA梯形电泳谱带,且诱导时间越长,梯型条带越明显。用流式细胞仪对线粒体膜电位(△Ψm)进行检测,结果表明,细胞经罗丹明(Rho-123)染色后在流式细胞仪上检测,处理2小时后即出现荧光强度下降,说明膜电位下降是细胞凋亡的早期事件,细胞凋亡过程中线粒体膜电位下降且呈时间依赖性。
(2)EndoG可能不存在于SL-1细胞中对哺乳动物细胞凋亡研究表明:EndoG属于Mg<2+>依赖性DNA/RNA非特异性核酸酶重要家族,由核基因编码,在细胞质中翻译成前体蛋白,随后转运至线粒体中切割掉其N端48个氨基酸变为成熟体.它是线粒体特异性核酸酶,在凋亡刺激下,一旦EndoG从线粒体膜间隙释放,能够切割细胞核染色质DNA,产生以核小体DNA长度为基数的DNA片段,这一过程是不依赖caspase活化的。
采甩western blotting检测SfaMNPV诱导SL-1细胞凋亡后,是否存在EndoG的释放,以及它在SL-1细胞线粒体和细胞质中的变化情况。实验结果显示在凋亡的SL-1细胞的细胞质及线粒体组分中均未检测到EndoG。由此表明在SfaMNPV诱导SL-1细胞凋亡中可能不存在EndoG从线粒体释放到细胞质中并最终作用细胞DNA的事件,提示在昆虫细胞凋亡中很可能并不存在非caspase依赖性凋亡通路。