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研究目的开展中药大黄（Rheum officinale）对应激性胃黏膜损伤患者临床治疗效果的观察,评估大黄的治疗效果;以细胞信号通路为研究靶点,探讨大黄中主要有效成分-大黄素（Emodin）对应激性胃黏膜损伤的保护作用及分子机制。研究方法1.临床实验本研究按照治疗方式不同将纳入实验的40名急性胃黏膜损伤病人分为两组,包括了治疗组和对照组。两组患者均依据病情,给予了病因的诊断、抗感染、改善微循环、护胃、早期营养支持等常规治疗。治疗组在奥美拉唑治疗基础上联合使用大黄,每日上午9点给药,给药剂量按大黄10g/人/天,7天为一个治疗周期。在治疗一个周期后,观察两组患者:①腹内压、急性胃肠损伤分级（Acute gastrointestinal injury,AGI）;②序贯器官衰竭评估（SOFA）评分、降钙素原（Procalcitonin,PCT）、血浆白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,,TNF-α）的血清浓度变化;③重症监护病房（Intensive care unit,ICU）住院时间、总住院时间及28d死亡率变化情况。2.动物实验①选用8-10周龄雄性清洁级（Sprague-Dawley）SD大鼠,体重180-200g,进行动物实验,动物实验分为3部分,第一部分动物实验分组（40只大鼠,随机分为4组,每组10只）,分别为正常对照组:正常饲养,不予以水浸束缚应激（Water Immersion and Restraint Stress,WIRS）7天后处死;应激性胃黏膜损伤1天组（WIRS-1D组）:予以水浸束缚16h建立WIRS模型,1天后处死;应激性胃黏膜损伤3天组（WIRS-3D组）:予以水浸束缚建立WIRS模型,3天后处死;应激性胃黏膜损伤7天组（WIRS-7D组）:予以水浸束缚建立WIRS模型,7天后处死。第二部分动物实验分组（50只大鼠,随机分为5组,每组10只）,分别为正常对照组:正常饲养,不予以水浸束缚应激;大黄素组:正常饲养大鼠腹腔注射大黄素（20mg/kg）;应激性胃黏膜损伤组（WIRS组）:予以水浸束缚16h建立WIRS模型,模型建立后0.5h腹腔注射200μL生理盐水;WIRS+大黄素低剂量组:WIRS模型建立后0.5h腹腔注射大黄素（20mg/kg）;WIRS+大黄素高剂量组:WIRS模型建立后0.5h腹腔注射大黄素（40mg/kg）,3天后断颈处死。第三部分动物实验分组（80只大鼠,随机分为4组,每组20只）,分别为正常对照组:正常饲养,不予以水浸束缚应激;应激性胃黏膜损伤组（WIRS组）:予以水浸束缚建立WIRS模型,模型建立后0.5h腹腔注射200μL生理盐水;WIRS+大黄素组:WIRS模型建立后0.5h腹腔注射大黄素（40mg/kg）;WIRS+大黄素+LY294002组:WIRS模型建立后0.5h腹腔注射大黄素（40mg/kg）及抑制剂LY294002（20mg/kg）,分别于相应时间断颈处死。②第三部分大鼠模型于相应处理时间断颈处死后,切开腹腔,游离胃组织,测定胃液pH值。然后取出胃,放置在10%中性甲醛液中固定10min,然后顺胃大弯弧度剪开,充分暴露胃腔,尽量展开胃黏膜,观察胃的形态及变化,计算胃溃疡指数（ulcer index,UI）。留取胃黏膜组织样品,病理切片观察胃黏膜组织结构的变化。③留取的胃黏膜组织样品,提取组织蛋白,经ELISA用以检验在胃黏膜组织中,血浆白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α的表达水平。观察大黄素对炎症因子表达水平的影响。④蛋白免疫印迹（Western Blot）用于测定胃黏膜组织中蛋白激酶（Protein kinase,Akt）、磷酸化蛋白激酶（Phosphor protein kinase,pAkt）、封闭蛋白（Occludin）、闭锁连接蛋白-1（Zonula Occludens-1,ZO-1）、B 淋巴细胞瘤分子-2（B-Cell lymphoma-2,Bc12）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 Associated X protein,Bax）等蛋白的表达水平,探讨大黄素对WIRS导致的大鼠应激性胃黏膜损伤的影响及PI3K/Akt信号通路在其中所起的作用。3.细胞实验①使用不同浓度的脂多糖（Lipopolysaccharide,,LPS）（0、2、5、10、20 μg/ml）处理人胃黏膜上皮细胞（Gastric epithelial cell-1,GES-1）细胞24、48、72小时,不同浓度大黄素（0、5、10、20、40μM）处理GES-1细胞24、48、72小时,通过细胞活力检测（Cell Counting Kit-8,CCK-8）实验明确LPS和大黄素对GES-1细胞增殖活力的影响,确定大黄素的最佳处理浓度。选择大黄素40μM为最佳保护浓度进行后续实验。继续设计实验,细胞分组:对照组:无任何处理,GES-1细胞无任何处理,正常培养;LPS组:10 μg/ml的LPS处理;LPS+大黄素组:加入10μg/ml的LPS和40μM的大黄素;LPS+大黄素+LY294002 组:加入 10μg/ml 的 LPS、40μM 大黄素和 15μM 的 PI3K/Akt 细胞信号通路抑制剂LY294002。分别处理24、48、72小时,进行CCK-8检测细胞增殖活力。②实验分组:对照组:GES-1细胞不作任何处理;LPS组:给予GES-1细胞10μg/ml的LPS;LPS+大黄素组:加入浓度为10μg/ml的LPS、40μM大黄素。LPS+大黄素+LY294002组:加入浓度为10μg/ml的LPS+40μM大黄素,同时添加15μM LY294002,培养48h,细胞划痕实验和细胞迁移及侵袭（Trans-well）实验检测各组GES-1细胞的迁移能力。用蛋白免疫印迹和免疫荧光实验分别检测Akt、pAkt、Occludin、ZO-1、Bax蛋白和Bcl2蛋白的表达水平,明确大黄素对PI3K/Akt信号通路的激活情况,验证大黄素对胃黏膜上皮细胞完整性的保护作用及机制。通过FDA-PI染色,光镜下观察细胞坏死情况,探讨大黄素对LPS导致的GES-1细胞坏死和凋亡的影响,明确PI3K/Akt信号通路在其中的保护作用及分子机制。研究结果1.临床实验①将治疗组与对照组相比,加用大黄治疗后,SOFA评分的改善情况要明显高于对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。②将治疗组与对照组相比,患者治疗前后ICU住院时间、总住院时间、28天死亡率无明显差异。③治疗组患者治疗一周后,与治疗前比较,患者AGI分级改善,腹内压明显下降,此差异有统计学意义（P＜0.05）,④两组患者治疗前血清IL-6、TNF-α表达明显增加。治疗组与对照组均治疗1周后,患者血清中IL-6、TNF-α表达均较治疗前下降,而治疗组下降更显著,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.动物实验①胃黏膜大体形态和HE染色检测发现,WIRS组大鼠胃黏膜组织出血明显,胃黏膜上皮组织遭到严重破坏,上皮组织完整性受损,胃黏膜损伤指数上升。随着造模时间推移,胃黏膜出血和胃黏膜组织结构情况并未好转。而大黄素干预后,WIRS+大黄素组胃黏膜出血现象减少,胃黏膜上皮组织完整性较好,高剂量大黄素显著促进胃黏膜组织修复,减少胃黏膜上皮组织损伤。而LY294002抑制剂能够抑制大黄素的保护作用,胃黏膜上皮组织完整性与WIRS组相似,无明显改善。②ELSIA检测结果发现,与对照组相比,WIRS组胃黏膜组织内IL-6、TNF-α的表达水平显著升高,提示炎症反应增强,而WIRS+大黄素组与WIRS组相比,胃黏膜组织内IL-6、TNF-α的表达水平显著降低。与WIRS+大黄素组相比,LY294002处理后,抑制了大黄素的抑制炎症的作用,WIRS+大黄素+LY294002组大鼠胃黏膜组织内IL-6、TNF-α的表达水平显著回升,与WIRS组无显著性差异。③Western Blot检测结果发现,与对照组相比,WIRS大鼠胃黏膜组织内pAkt、Occludin、ZO-1、Bc12表达水平显著降低,Bax表达水平显著升高。而大黄素处理后,与WIRS组大鼠胃黏膜组织相比,pAkt、Occludin、ZO-1、Bc12等蛋白的表达水平在胃黏膜组织中显著升高,Bax的表达水平显著降低。然而,LY294002抑制了大黄素的保护作用,与WIRS组相比,pAkt、Occludin、ZO-1、Bcl2、Bax的表达水平无显著性差异。3.细胞实验①CCK-8检测发现,LPS处理时间越长,GES-1细胞的增殖活力越低;LPS浓度越高,细胞增殖活力越低。不同浓度的大黄素对GES-1细胞的增殖活力无明显影响。而大黄素可减少LPS对GES-1细胞增殖活力的损害,大黄素的这种保护作用可被PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002所阻断。②细胞划痕和Trans-well实验中,LPS处理后抑制了GES-1细胞的迁移能力,减少了穿孔细胞数量,而与LPS组相比,大黄素可以显著促进GES-1细胞迁移和穿孔数量。相反地,LY294002抑制了大黄素的促迁移能力。③FDA-PI染色显示发现,LPS导致GES-1细胞坏死凋亡,而大黄素处理减少了细胞坏死凋亡,LY294002组GES-1细胞坏死凋亡增多,抑制了大黄素的抗凋亡作用。④Western Blot检测结果发现,与对照组相比,LPS组上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达水平显著降低,Bc12、pAkt蛋白表达水平降低,而凋亡标记蛋白Bax蛋白表达水平显著升高。而大黄素处理组能够上调pAkt、Occludin、ZO-1和Bcl2蛋白的表达水平,减少Bax的表达。且pAkt、Occludin、ZO-1、Bcl2和Bax的表达水平存在浓度依赖性。与大黄素组相比,LY294002处理可以抑制大黄素的保护作用,导致pAkt、Occludin、ZO-1和Bc12蛋白的表达水平降低,Bax表达水平回升。⑤免疫荧光结果显示LPS可以使GES-1细胞的紧密连接发生破坏,从而导致紧密连接蛋白和Occludin和ZO-1的表达水平降低,而大黄素组Occludin和ZO-1的表达水平升高,LY294002组Occludin和ZO-1的表达水平则被抑制。研究结论①大黄可以有效改善应激性胃黏膜损伤患者SOFA评分、AGI分级、腹内压,降低炎症因子水平。②大黄素能够通过激活PI3K/Akt信号通路保护WIRS大鼠胃黏膜上皮组织,维持胃黏膜上皮组织完整性,减轻WIRS大鼠胃黏膜炎症反应导致的胃黏膜损伤,而PI3K/Akt细胞信号通路抑制剂LY294002能够抑制大黄素的保护作用。③大黄素可保持胃黏膜上皮细胞紧密连接的完整性,并促进胃黏膜上皮细胞紧密连接蛋白Occludin与ZOL-1的表达,其发挥作用的机制可能是通过激活PI3K/Akt细胞信号通路来实现。