银杏黄酮具有广泛的生物活性,包括抗氧化活性、抗肿瘤活性、抗炎症等。银杏提取物(Ginkgo biloba extracts, GBE)可用常规水、醇水溶剂浸提方法得到,使用酶法辅助提取银杏黄酮已见报道,但通常都使用纯化的纤维素酶辅助提取,不适合大规模的工业化生产,我们尝试使用由银杏内生菌产纤维素酶菌株发酵液辅助醇水法提取银杏黄酮,提高银杏黄酮提取率。本文通过分离银杏内生菌,筛选高产纤维素酶菌株并优化产酶条件,建立发酵液应用于银杏黄酮提取的辅助技术,同时,对银杏内生菌纤维素酶进行了分离纯化,对产酶内生菌开展了分子鉴定,我们的研究为内生菌在中药提取中的应用提供了方法和技术参考。内生菌纤维素酶在黄酮提取中的辅助应用为我们首次报道。首先对银杏内生菌进行了分离纯化,共分离出71株菌株,再通过刚果红染色及发酵液酶活测定最终筛选出1株高产纤维素酶菌株,暂定编号为Y2菌。筛选和优化了真菌Y2的产酶培养基及产酶条件,最终确定培养基:马铃薯20%,葡萄糖2%,KH2PO4 0.3%,MgSO4 0.15%,维生素B1 10 mg/L,酵母膏0.5%。发酵最佳条件:温度28℃,转速150 rpm,装液量200 mL/500 mL,该条件下培养6 d后测定酶活达4.47 U/mL。我们对分离到的活性真菌Y2进行了形态学观察及分子鉴定,经过玻片小培养、光学显微观察,基本确认为青霉属真菌。为进一步了解该菌,又进行了DNA的提取及rDNA的ITS(Internal Transcribed Space)区段分子鉴定,DNA提取采用真菌常用的CTAB法,提取的DNA符合质量标准,PCR扩增条件经过筛选为:94℃预变性3 min→94℃40 s→52℃1.0 min→72℃1.0 min,30个循环后72℃8 min。取5 mL产物于1.5%的琼脂糖凝胶100 V电泳,在紫外灯下观察结果,PCR产物单一,条带清晰。分子鉴定PCR扩增片段,经测序获得亚基,共564个碱基,GenBank核酸序列数据库中进行blast搜索结果,序列与草酸青霉有100%的同源性,结合形态学观察确定为草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)。对草酸青霉菌纤维素酶进一步进行了蛋白分离和纯化,通过硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析、Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析获得了电泳纯的纤维素酶CMCase组分,并对该组分酶学性质进行考察。纯化后蛋白质总量下降了89.87%,总酶活下降了30.65%,酶的比活力达到466.59 U/mg,提高到原来的6.67倍,酶的总回收率为10.13%,该酶的分子量约为34.2 kD。该纤维素酶纯化组分最佳酶解温度为50℃,最佳酶解pH为5.0。Fe3+、Fe2+、Al3+离子对酶活有一定的激活作用,Zn2+、Cu2+、Hg2+对酶活有很强的抑制作用,在酶的稳定性研究中表明该酶最佳保存温度为低于50℃,最佳保存pH为5.0。该纤维素酶Km值为2.13 mg/mL,Vmax为0.22 mg/mL/min。建立了HPLC法测定银杏总黄酮(槲皮素、山奈酚、异鼠李素)的方法,确定色谱条件:色谱柱为Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为甲醇:0.4%磷酸溶液= 59:41;流速为1.0 mL/min;柱温为30℃;进样量为20μL;检测波长为360 nm。我们还研究了银杏鞣质对纤维素酶活性的抑制,并筛选了去除该类抑制剂的有效吸附剂胶原纤维。同时,优化了纤维素酶发酵液辅助提取银杏黄酮的条件,通过单因素试验和正交试验,得出纤维素酶发酵液酶解银杏叶的最佳条件为:酶料比15:1加入银杏干粉中,在pH5.0、温度50℃下,酶解处理3 h,该条件下的银杏黄酮提取率达到了1.33%,比常规醇提法提高了18.75%。本研究从银杏中筛选出一株高产纤维素酶的内生菌,经分子鉴定为草酸青霉菌。我们分离和纯化了草酸青霉纤维素酶,确定了该酶的生化性质。通过该菌株培养条件的优化,成功地利用该菌的发酵液辅助提取银杏总黄酮,有效地提高了银杏黄酮提取率。本研究为内生菌研究和中药提取提供了新思路,也为中药材酶法提取的大规模应用提供了可能。