目的：1.研究益气除痰方对A549肺癌裸小鼠移植瘤生长的抑制作用。2.研究益气除痰方诱导A549肺癌裸小鼠的肿瘤细胞及体外A549细胞凋亡的作用。3.研究益气除痰方对PERK-eIF2a信号通路活化水平的影响。方法：1.动物造模及分组给药：采用培养细胞移植法接种A549细胞悬液于BalB/CA-nu品系裸小鼠右腋背部皮下。待裸小鼠右腋部均可扪及到皮下肿瘤的平均长径约5mm时,将裸小鼠按配对设计随机分为4组,每组8只,组别为：模型组,中药组、化疗组、联合组。给药：模型组予生理盐水0.4mL/只/day灌胃,每天一次,连续2周；中药组予益气除痰方汤药约0.4mL/只/day剂量(27.3g/kg/day)灌胃,每天一次,连续2周；化疗组予0.1g/mL的顺铂生理盐水溶液以0.4mL/只/day(2mg/kg/day)腹腔注射,每天一次,连续5天；联合组：益气除痰方以约0.4mL/只/day剂量(27.3g/kg/day)灌胃给药,每天一次,连续2周；前5天连续予0.1g/mL的顺铂生理盐水溶液以0.4mL/只/day (2mg/kg/day)腹腔注射,每天一次。2.体重的称量及瘤径的测量：给药期间每周二次(选择第1天、第5天、第9天、第14天)用精密电子秤称量A549肺癌裸小鼠体重。同时,用千分尺测量A549肺癌裸小鼠瘤体的长径(a)和短径(b),按公式V=0.5ab2计算肿瘤体积。根据统计学方法分析给药第14天与第1天的各组A549肺癌裸小鼠的的瘤体体积差,评价益气除痰方对A549肺癌裸小鼠的瘤体生长的抑制作用。3.瘤重的称量：停药1天后,每组随机选出3只A549肺癌裸小鼠观察生存期,将其余5只脱颈处死,并剥离裸小鼠肿瘤瘤体。称量瘤体重量,计算肿瘤生长抑制率及瘤体重量指数。4.流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率：切取约0.1g的肿瘤组织块,经100目钢筛网搓磨,经预冷PBS缓冲液冲洗,收集细胞混悬液。经300目尼龙网过滤至流式细胞管(冰水浴)中。经离心机1200rpm离心5min,弃去上清液,加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞,在模型组中一只流式细胞管中加入5μL Annexin V-FITC混匀,在模型组另一只流式管中加入5μL Propidium Iodide混匀。其余所有流式细胞管中先加入5μL Annexin V-FITC混匀后,再加入5μL Propidium Iodide混匀,室温、避光,反应10min,加入1mLPBS后上机检测。5.脏器组织的病理学观察：将裸小鼠进行解剖,取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏,放入4%甲醛溶液中固定24h,流水冲洗24h,置于75%乙醇中保存。后经脱水、包埋、切片等处理后进行HE染色。在生物显微镜下观察各组A549肺癌裸小鼠的脏器组织形态学结构。6.免疫组化法检测：切取约0.3g的肿瘤组织块,生理盐水漂洗,4%甲醛溶液5mL固定24h,流水冲洗多次。经脱水、包埋、切片等处理后,通过免疫组化SP法检测肿瘤组织中PERK、eIF2α、p-eIF2α蛋白的表达。7.空白血清及含药血清的制备：将SPF级SD大鼠随机分为2组,每组15只,组别为：阴性对照组,中药组。待各组大鼠体重均达到200g左右时开始给药,阴性对照组：以0.5%羧甲基纤维素钠2mL/只/day灌胃,每天一次,连续7天；中药组：以0.5%羧甲基纤维素钠益气除痰方2mL/只/day(63g/kg/day)灌胃,每天一次,连续7天。第7天给药后1-2h,经腹腔注射10%水合氯醛麻醉,麻醉后无菌条件下使用10mL注射器腹主动脉取血,将血液缓慢注入无菌试管,将推至末端的血弃掉,防止挤压过度产生溶血。采血后静置2h,3000rpm,离心15min,1.5mL EP管分装,置-20℃冰箱保存备用。30%大鼠空白血清培养液的配制：取15mL离心管,用3mL巴氏吸管分次加入共7mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,后用3mL巴氏吸管吸取3mL提前解冻的大鼠空白血清,混匀,封口胶封管,放置于4℃冰箱备用。30%大鼠含药血清培养液的配制：取15mL离心管,用3mL巴氏吸管分次加入共7mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,后用3mL巴氏吸管吸取3mL提前解冻的大鼠含药血清,混匀,封口胶封管,放置于4℃冰箱备用。8.倒置显微镜观察A549细胞形态：将对照组、实验组的A549细胞分别用30%大鼠空白血清培养液、30%大鼠含药血清培养液培养24h后,在倒置显微镜下观察A549细胞形态学变化。9.透射电镜观察A549细胞超微结构：倒出对照组、实验组的培养瓶中的培养液,采用胰蛋白酶消化,再加入适量培养液进行1000rpm离心10min左右。离心完毕倒出培养液,倒入适量的3%戊二醛固定液固定,4℃过夜。经浸泡双重固定(分别使用3%戊二醛、1%四氧化锇)、脱水、渗透、包埋、制包埋块、切片、醋酸铀和柠檬酸铅双染色等处理,在Tecnai G2Spirit Twin型透射电镜下观察A549细胞超微结构。10. Western blot法检测：提取对照组、实验组A549细胞总蛋白,BCA法测定两组蛋白样品浓度,进行SDS-PAGE电泳、转膜、免疫印记等步骤,检测PERK、p-PERK、 eIF2α、p-eIF2α的表达。11.统计学分析方法：采用SPSS17.0软件包进行统计学分析,所得实验数据以平均值±标准差(x±S)表示,进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间比较使用LSD检验,P<0.05认为有统计学意义。结果：1.模型组、中药组、化疗组、联合组的A549肺癌裸小鼠生存期均超过3个月。2.联合组的A549肺癌裸小鼠的体重是基本平稳增加的；中药组的A549肺癌裸小鼠的体重在给药前期、中期是逐渐增加的,后期较前有所下降；化疗组的A549肺癌裸小鼠体重在前期都是逐渐下降的,中期、后期是逐渐增加的；模型组A549肺癌裸小鼠的体重是在前期下降,中期逐渐上升,后期又持续下降。3.中药组、化疗组、联合组的A549肺癌裸小鼠的瘤体体积均较模型组的A549肺癌裸小鼠的瘤体体积小,但中药组、化疗组、联合组的A549肺癌裸小鼠给药14天与给药1天的瘤体体积差与模型组比较,差异均没有统计学意义(P>0.05)。4.模型组、中药组、化疗组和联合组的A549肺癌裸小鼠的瘤重分别为0.532±0.052g、0.492±0.087g、0.394±0.090g、0.250±0.094g。中药组、化疗组和联合组的A549肺癌裸小鼠的瘤重都较模型组A549肺癌裸小鼠的瘤重小,中药组与模型组比较差异没有统计学意义(P>0.05)；化疗组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；联合组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.001)。化疗组的瘤重虽然较中药组小,但与中药组比较差异未有统计学意义(P>0.05)；联合组的瘤重比中药组小,与中药组比较差异具有统计学意义(P<0.001)。联合组的瘤重比化疗组小,与化疗组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。而在抑瘤率方面,化疗组达25.9%,明显高于中药组的7.5%；联合组更高达53.0%,又明显高于化疗组,这说明益气除痰方与顺铂联合具有协同增效的抑瘤作用。模型组、中药组、化疗组和联合组的A549肺癌裸小鼠的瘤重指数分别为2.256±0.237%、1.862±0.301%、1.628±0.171%、1.034±0.371%。中药组、化疗组、联合组的A549肺癌裸小鼠的瘤重指数均比模型组小,中药组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；化疗组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；联合组与模型组比较具有统计学意义(P<0.001)。化疗组的瘤重指数比中药组略小,但与中药组比较差异未有统计学意义(P>0.05)。联合组的瘤重指数比中药组小,与中药组比较差异具有统计学意义(P<0.001)；联合组的瘤重指数比化疗组小,与化疗组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。5.模型组、中药组、化疗组、联合组的肿瘤细胞凋亡率分别为4.60±2.21%、12.33±4.30%、18.17±3.95%、25.60±4.68%。中药组肿瘤细胞的凋亡率高于模型组,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；化疗组肿瘤细胞的凋亡率高于模型组,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；联合组肿瘤细胞的凋亡率高于模型组,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.001)。化疗组肿瘤细胞的凋亡率高于中药组,但与中药组比较差异未有统计学意义(P>0.05)。联合组肿瘤凋亡率高于中药组,与中药组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；联合组肿瘤凋亡率高于化疗组,与化疗组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。6.生物显微镜下见到模型组、中药组、化疗组、联合组的A549肺癌裸小鼠的肝脏组织出现肝中央静脉瘀血,但各组之间的瘀血情况没有明显差异,提示原因可能是处死动物时放血不彻底所致,与药物毒性无关。各组的A549肺癌裸小鼠其余脏器未见明显异常。7.免疫组化法检测PERK在A549肺癌裸小鼠肿瘤组织中呈胞浆染色。模型组中PERK的强阳性表达率为80%,弱阳性表达率为20%：中药组中PERK完全呈弱阳性表达,表达率为100%。eIF2α在A549肺癌裸小鼠肿瘤组织中呈胞浆染色。模型组中eIF2α完全呈强阳性表达,表达率为100%；中药组中eIF2α完全呈弱阳性表达,表达率为100%。p-eIF2α在A549肺癌裸小鼠肿瘤组织中呈胞浆染色。模型组中p-eIF2α弱阳性表达率为20%,阴性率为80%；中药组的p-eIF2α完全呈弱阳性表达,表达率为100%。8.倒置显微镜下见对照组A549细胞贴壁生长良好,细胞间连接紧密,呈梭形或多突起形,胞浆丰满均匀,核大,位于细胞中心；实验组A549细胞中部分细胞体积增大,细胞膜呈泡状；部分细胞出现突起短缩,胞浆减少,体积缩小,变圆,甚至可见到一些细胞脱落悬浮于培养液中。9.透射电镜下见对照组呈现出恶性肿瘤细胞特征。细胞核增大、畸形,细胞核与细胞浆比例失调,细胞核核膜完整、清晰,细胞膜完整,胞质内线粒体肿胀,粗面内质网基本正常。实验组呈现出细胞凋亡早期的特点。细胞体积明显缩小,细胞膜结构完整,核形不规整,核内异染色质碎裂、边集,浓缩成团块或条块状,分布在核膜的内侧,胞质内线粒体肿胀,粗面内质网扩张。10. Western blot检测对照组的PERK、eIF2α的灰度值明显高于实验组；实验组的p-PERK、p-eIF2α的灰度值明显高于对照组。结论：1.益气除痰方对A549肺癌裸小鼠移植瘤的生长具有抑制作用。2.益气除痰方可以诱导A549肺癌裸小鼠的肿瘤细胞及体外A549细胞凋亡,说明诱导肿瘤细胞凋亡可能是益气除痰方抑制肿瘤生长的作用机制之一。3.益气除痰方与顺铂联合在抑制A549肺癌裸小鼠的移植瘤生长、促进A549细胞凋亡方面有协同增效作用。4.益气除痰方能够激活PERK-eIF2α信号通路,而其诱导A549细胞凋亡的作用可能与PERK-eIF2α信号通路的激活有关。