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针刺干预对帕金森病模型小鼠运动障碍及肠道功能障碍治疗的效应机制研究目的首先,从帕金森病模型小鼠前驱期胃肠道功能障碍入手,探讨早期针刺干预帕金森发病进程的效应与机制;其次,探索黑质-迷走神经运动背核之间的投射关系,更深层次地探讨帕金森胃肠功能障碍发生的神经解剖学机制;最后,体外建立帕金森细胞模型,探讨鱼藤酮诱导小胶质细胞激活促进多巴胺能神经元损伤的作用及分子机制。方法1.通过长期低剂量皮下注射鱼藤酮诱导PD小鼠模型再现帕金森典型神经病变和胃肠道症状。通过对PD模型小鼠症状、体征的持续观察,以及不同时间节点小鼠粪便含水量、肠推进率、神经行为学的测试,探讨帕金森病模型小鼠便秘与运动障碍发生的相关性;其次,于造模当天开始针刺干预,观察电针早期干预对鱼藤酮诱导的PD小鼠症状体征、神经行为学、肠道炎症、结肠神经递质合成酶、中脑黑质和迷走神经运动背核TH、Iba-1及帕金森特征性病理蛋白表达的影响,从行为学、肠神经系统、中枢神经系统全面研究电针干预帕金森模型小鼠的作用机制;2.运用顺行神经示踪剂VSV-EGFP注入小鼠中脑双侧黑质致密部（SNc）,检测迷走神经背核（DMV）是否存在VSV-EGFP顺行标记的神经元;运用逆行示踪剂CTB注入小鼠脑干DMV,检测SNc是否存在CTB逆行标记的神经元;对SNc、DMV处VSV-EGFP标记的神经元和TH-IR神经元进行共定位荧光染色,研究示踪剂标记的神经元神经化学表型;3.选择鱼藤酮作为神经毒素处理BV-2细胞后取上清与MN9D细胞共培养建立PD细胞模型,通过基因沉默抑制“炎症小体”成分NLRP3,用MTT法检测BV-2、MN9D细胞活性,ELISA检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8水平,Weste-blot法检测NLRP3、pro-Caspase-1、caspase-1等蛋白水平,免疫荧光染色分析小胶质细胞形态变化及流式细胞检测神经元细胞凋亡情况,探讨NLRP3炎症小体活化在鱼藤酮诱导小胶质细胞激活促进DA能神经元损伤中的作用及分子机制。结果1.长期低剂量皮下注射鱼藤酮可成功复制帕金森有序的渐进的自下而上的前驱期胃肠功能障碍至运动障碍的发病过程;电针早期干预可显著改善模型小鼠食量、粪便性状、含水量及肠道推进率,增加PD小鼠的自发活动,从而对改善运动障碍起到一定作用;电针显著增加了中脑黑质酪氨酸羟化酶（TH）的表达,降低了Iba-1的表达,显现出减轻神经病理损伤的作用。此外,电针可显著减少结肠、黑质及迷走神经运动背核中α-突触核蛋白的沉积;还可增加结肠乙酰胆碱转移酶（Ch AT）,酪氨酸羟化酶TH,n NOS,紧密连接蛋白（ZO-1）和Occludin的表达以减轻肠道炎症,并对PD小鼠的肠神经系统和肠屏障起到保护作用。2.在SNc中微量注射顺行示踪剂VSV-EGFP,6天后顺行示踪剂VSV-EGFP标记了整个DVC头尾部的纤维;将逆行示踪剂霍乱毒素亚单位B（CTB）注入双侧DVC,荧光显微镜下,切片染色显示CTB浓染区局限在双侧DVC包括DMV和NTS,CTB标记的末端出现在红色荧光颗粒中,跨神经节标记的纤维终止于外侧NTS的尾部;14天后,发现CTB阳性神经元散布在SNc中。此外,对SNc、DMV处TH-IR神经元与顺行示踪剂VSV-EGFP共定位染色发现,这些VSV阳性神经元具有TH免疫反应性,表明其儿茶酚胺能,多巴胺能神经化学表型。3.给予BV-2小胶质细胞不同时段（0h、6h、12h、24h）5 nmol/L鱼藤酮处理后,可引起BV2细胞发生明显的形态学变化。暴露于鱼藤酮的BV2小胶质细胞可诱导大量促炎因子的产生,其中IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α浓度随暴露时间的延长而显著升高,在24h时达峰值;鱼藤酮可直接在BV-2小胶质细胞中激活NLRP3炎性小体,被激活的NLRP3炎症小体自身表达水平不仅会随鱼藤酮孵育时间的延长而升高,而且还会提高炎症小体多蛋白复合物其他组分的表达;NLRP3沉默可减缓BV-2细胞的活化,抑制BV2细胞分泌IL-1β、IL-8、TNF-α炎症因子,减少鱼藤酮引起的caspase-1活化;siRNA-NLRP3一定程度上减缓了鱼藤酮对MN9D神经元细胞活性的损伤,保护了MN9D神经元细胞形态结构的完整;此外,siRNA-NLRP3还显著抑制了MN9D神经元细胞中α-syn的表达,升高了TH、Neurofilament的表达。结论1.电针对PD小鼠的胃肠功能和运动功能均有良好的调节作用,并且可以通过减轻肠道炎症,促进肠屏障修复和减少结肠中α-syn沉积来减轻PD的神经炎症和神经损伤。2.本研究应用神经示踪技术在c57小鼠身上发现了一条跨突触SNc-DMV通路,证明了包括迷走神经运动背核和孤束核在内的迷走神经复合体接受来自黑质神经元的直接投射。3.采用BV2/MN9D细胞系模拟体外帕金森病发病原理,通过实验证实鱼藤酮可通过激活NLRP3炎性小体诱导小胶质细胞活化,释放促炎因子,并进一步引发多巴胺神经细胞的凋亡,而沉默NLRP3炎性小体可以抑制鱼藤酮诱导的MN9D细胞的凋亡及炎症级联反应的发生。