论文部分内容阅读
南极是一个终年低温、对生命充满挑战的地方,在这种恶劣环境下生存的微生物经过长期的进化产生了适应低温环境的生命特征,如细胞生物膜的组成变化,蛋白质结构和功能的调整等。南极嗜冷/适冷微生物产生的低温酶具有独特的生理生化特征,即具有极高的催化常数(Kcat)值,同时具有较低和较稳定的米氏常数（Km）值,其主要特征是具有较低的活化能和低温下的酶活力。在某些领域有着中温酶所不可比拟的优越性。本研究通过构建产低温脂肪酶活力较高的南极适冷菌Psychrobacter sp. G的基因组DNA质粒文库,利用鸟枪法克隆到两个包含调控区在内的开放读码框架分别为1452 bp （Lip-1452）和948 bp （Lip-948）的低温脂肪酶全长基因。由基因序列推测的两个脂肪酶的氨基酸序列的N端均包含了以丝氨酸为活性中心的保守五肽（Lip-1452,GDSAG;Lip-948,GNSMG）和保守二肽His-Gly。蛋白序列比对和保守区分析表明,这两个脂肪酶分别属于细菌脂肪酶家族Ⅳ和Ⅴ。将低温脂肪酶基因Lip-1452和Lip-948分别克隆到表达载体pColdⅢ中,并转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）,酶活力测定结果显示基因Lip-948异源表达后酶活力较高。将Lip-948分别克隆到不同的表达载体pColdⅠ、pET32a、pMAL-c4x中,转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）中并进行了诱导表达。SDS-PAGE表明均实现了Lip-948在E. coli的中异源表达,不同表达载体对LIP-948可溶性表达程度有所不同,在上述三种载体中可溶性表达脂肪酶占总脂肪酶蛋白的比例分别为4.5%、18.0%、55.6%;细胞破碎液上清酶活力分别为5.33 U/mL、5.83 U/mL、5.83 U/mL。对重组菌pColdⅢ+ Lip-948/BL21（DE3）产酶条件进行了优化,结果表明,诱导物IPTG最佳终浓度为0.5 mmol/L,诱导时的菌体浓度OD600为0.4-0.6,最佳培养温度为15℃,最佳诱导时间为24 h。将重组质粒pColdⅠ+ Lip-948分别与不同分子伴侣质粒如pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16在E. coli BL21（DE3）中进行了共表达研究。结果表明,与5种不同的分子伴侣共表达能够在不同程度上增加或减少脂肪酶LIP-948的可溶性表达。与分子伴侣质粒pTf16和pGro7共表达后减少LIP-948的可溶性表达,而与编码多个分子伴侣的质粒（pKJE7、pG-Tf2和pG-KJE8）共表达后能提高LIP-948的可溶性表达。当与编码分子伴侣最多的质粒pG-KJE8共表达后,可溶性LIP-948比例达到19.8%,且酶活达到108.77U/mg。通过亲和层析得到了纯化的低温脂肪酶LIP-948,并对其进行了酶学性质研究。结果表明,LIP-948的最适反应温度为35℃,最适pH为8,热稳定性较差,在50℃保温15 min酶活即显著下降;金属离子Sr2+和Ca2+能够显著提高LIP-948的酶活力;该酶更倾向于降解短C链的4-Nitrophenyl底物。