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随着海洋资源的开发利用和水母数量的增多,水母伤人事件越来越多,有毒水母蜇伤成为最常见的海洋生物伤。水母毒素是一类结构新颖的肽类毒素,相对分子量从10-600 kDa不等,文献报道的活性成分差异显著。研究发现水母毒素具有细胞、心血管、神经、肌肉、呼吸、循环、酶和皮肤坏死等多种生物活性,其中细胞毒性是水母毒素最具普遍意义的生物活性,在水母蜇伤中毒中起重要作用。目前水母毒素研究主要集中在毒素对整体动物或离体脏器功能的影响等方面,更深入的细胞毒性作用及其机制尚无明确报道,有待进一步研究。本文初步探讨了TOE体内外溶红细胞毒性作用及其作用机制,提出稀释的全血是一种比红细胞悬液更加方便有效的溶血活性测定系统,并分析了TOE对4种离体细胞的毒性效应,测定毒素作用后细胞中Ca2+、ATPase、MDA等各个指标的变化,旨在从细胞水平研究TOE的毒性作用。方法为：首先,以红细胞为代表检测TOE的溶细胞活性(溶血活性),体外比较SD大鼠稀释的全血与红细胞悬液的溶血活性差异,观察各种金属阳离子对溶血活性的影响；体内追踪TOE的溶血过程。观测TOE对红细胞渗透脆性的影响,电镜观察红细胞膜的变化,SC5b-9测定试剂盒检测其在毒素作用前后活性水平。将稀释全血和红细胞悬液两套测试系统扩展到包括人在内的其它几种动物血样进行比较研究,观察抗氧化剂对溶血活性的影响,验证全血测试系统的实用性,利用血浆和血清白蛋白干预探讨溶血的可能机制。其次,原代培养SD大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs),与多种肿瘤细胞相比较,MTT法检测TOE对所培养细胞生存率的影响,测定LDH进一步反映TOE的细胞毒性作用,显微镜下观察细胞形态学变化。利用荧光探针Fluo-3观测TOE作用后细胞内Ca2+的动态变化,利用试剂盒分别测定正常细胞与TOE作用后细胞Ca2+、ATPase、MDA、NO等水平的变化。分别取TOE作用前后大鼠胸主动脉血管,组织匀浆后测定Ca2+含量变化。结果表明,TOE的溶血活性在大鼠稀释全血和红细胞悬液两个测试系统中都具有剂量依赖性,且红细胞悬液中的溶血活性高于稀释全血。Mn2+,zn2+,La3+,Cu2+和Fe2+能显著抑制TOE的溶血活性。当给予TOE(5mg/kg i.v.)后,麻醉SD大鼠血清OD414在前10 min显著快速上升,在接下来的3小时内逐渐升高。最大和最小红细胞渗透脆性在加入TOE(5mg/kg i.v.)后随着时间延长明显增加。透射电镜观察给予TOE(5mg/kg)30 min后的SD大鼠的动脉血细胞样本,发现在一些正常形态的红细胞表面有大量未知的复合物。体外SC5b-9复合物在与TOE共培养后呈显著性上调,而静脉给予TOE(5mg/kg)180min内未见显著性差异。利用稀释全血和红细胞悬液两套溶血测试系统做比较研究发现,红细胞悬液中的溶血活性普遍高于稀释的全血。抗氧化剂GSH和VC能抑制TOE的溶血活性,蛋白酶抑制剂对溶血活性影响不明显。血清和单纯的血浆成分-白蛋白对溶血活性有明显剂量依赖性的抑制作用。MTT法检测结果表明,TOE对4种贴壁细胞均产生细胞毒性作用,且原代培养的VSMCs比3种肿瘤细胞对毒素作用更为敏感。毒素作用后,VSMCs上清中LDH活性较正常细胞上清液明显升高。镜下观察不同浓度TOE作用24h后各组细胞的形态发现,随TOE剂量的升高,细胞漂浮、肿胀、折光性差等变化更加明显,大量细胞破裂、崩解、死亡。Fluo-3追踪TOE作用后VSMCs胞内Ca2+的动态变化发现,10 min内胞内Ca2+出现明显的升高过程,随之进入平原期,1小时后又一次较大幅度的升高。TOE作用后匀浆细胞中Ca2+水平升高,而Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活性没有明显变化,MDA及NO变化也不明显。TOE作用后SD大鼠血管平滑肌组织匀浆也显示了Ca2+升高的变化趋势。本文首次同时使用稀释全血和红细胞悬液两套测试系统进行体外溶血活性检测,发现TOE在红细胞悬液中的溶血活性普遍高于稀释的全血,表明血浆中白蛋白成分可能具有溶血保护作用。TOE在体内的溶血过程分为两个阶段：第一阶段为快速直接的溶血,随后是渐进的溶血,体内溶血与体外溶血的过程是不一致的。综合多种阳离子和抗氧化剂对溶血活性的影响、红细胞渗透脆性实验、透射电镜观察、SC5b-9活性测定等实验结果,推测氧化损伤和孔道形成在TOE的溶血过程中起主要作用。采用原代培养VSMCs细胞检测TOE对细胞的毒性作用,发现与肿瘤细胞相比,VSMCs细胞对TOE最为敏感,这进一步证明水母毒素作用靶点主要是心血管。TOE作用后胞内钙水平出现升高-平衡-升高的动态变化过程,说明胞内Ca2+升高可能首先是细胞膜损伤或通过离子通道发生钙内流引起的直接钙升高,其次可能是通过其它方式间接引起的钙升高。通过TOE作用前后Ca2+、ATPase、MDA、NO等水平的变化可以推测,毒素作用后细胞内钙超载可能是细胞死亡的直接原因。