论文部分内容阅读
背景:随着人口老龄化趋势的不断发展,骨质疏松症（Osteoporosis,OP）已经成为严重威胁老年人健康的常见病和多发病。流行病学显示,我国60岁以上老年人骨质疏松症的发生率已高达36%。骨质疏松症的主要病理改变为骨小梁变细、数量减少及间隙增宽等骨微细结构的破坏,具有全身骨痛及易于发生骨折等临床特点。大多数骨质疏松症病人需要终生治疗和调理。目前临床上用于防治骨质疏松症的药物包括化学药物和中医。虽然化学药物,如二磷酸盐类、雌激素等有一定疗效,但长期使用后所导致的不良反应及并发症较多,所以寻找更为安全有效的药物是防治的重要任务。淫羊藿苷（Icariin,ICA）分子式:C33H40O15,分子量:676.67,是传统抗骨质疏松中药淫羊藿的主要活性成分。大量研究表明,ICA可促进骨形成、抑制骨吸收,提高骨密度及影响骨代谢指标,具有明显的抗骨质疏松作用。然而,对其作用机理及分子机制方面的研究仍不够全面,故ICA在预防骨质疏松方面仍需要更深入地研究。本课题组前期发现,ICA可通过上调成骨细胞BMP-2蛋白的表达,进一步诱导成骨细胞的增殖、分化。研究发现,ICA对体外培养的成骨细胞有较强的诱导分化作用,其作用机制可能与ICA促进成骨细胞Smad1和Smad5基因表达有关。已知Runx2是成骨细胞的特异转录因子,BMP-2/Smads信号通路在成骨细胞分化过程中起着重要的作用。通过以上研究,我们推测ICA可能是通过上调成骨细胞BMP-2蛋白的表达,激活BMP-2/Smads信号通路,进一步启动下游成骨基因Runx2的表达,从而促进成骨细胞的增殖、分化,发挥抗骨质疏松的作用。本实验以小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1subclone 14）为细胞模型,研究ICA对其细胞形态、细胞增殖活性以及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响,同时研究BMP-2/Smads/Runx2信号通路在其中的作用,为ICA治疗骨质疏松等骨代谢疾病提供分子依据。目的:研究淫羊藿苷（ICA）对MC3T3-E1前体成骨细胞增殖、分化的影响,以及BMP-2/Smads/Runx2信号通路在成骨细胞增殖、分化中的作用。方法:用含不同浓度ICA（0、10、20、40 ng/ml）的完全培养液分别培养MC3T3-E1细胞48、72和96h。分别用CCK-8及碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒检测ICA对MC3T3-E1细胞增殖活性和细胞ALP活性的影响;Western blot检测ICA对MC3T3-E1细胞BMP-2,BMPR-2,Smad4和Smad1/5/8蛋白表达水平的影响;RT-PCR检测ICA对MC3T3-E1细胞Runx2基因m RNA表达的影响。向细胞培养液中加入BMP抑制剂Noggin（100 ng/ml）阻断BMP-2/Smads信号通路后,再次检测上述各实验指标的变化。结果:1、不同浓度的ICA孵育细胞48、72h后,倒置显微镜下见细胞形态饱满,呈多角形或梭形,各ICA浓度组间细胞形态无明显差异;96 h后镜下见细胞排列紧密,部分细胞伸出突起,胞浆丰富,细胞核较清晰,各ICA浓度间细胞亦无明显差异。2、10、20 ng/ml ICA组细胞增殖活性较对照组（ICA,0 ng/ml）显著增强（p均＜0.01）,其中20 ng/ml ICA组细胞活性更强,并且于96 h时细胞增殖活性达到最高,而40 ng/ml ICA组细胞活性与对照组无明显差异（p＞0.05）;向细胞中加入Noggin,观察ICA（20 ng/ml）与Noggin（100 ng/ml）共同培养MC3T3-E1细胞72 h后对细胞增殖活性的影响,结果显示与ICA（20 ng/ml）组相比,ICA+Noggin组细胞增殖活性明显受到抑制（p＜0.01）;与ICA（0 ng/ml）组相比无明显差异（p＞0.05）。3、各组在培养48、72、96 h后,10和20 ng/ml ICA组细胞ALP活性较对照组显著增高（p均＜0.01）,40 ng/ml ICA组细胞ALP活性与对照组无显著差异（p＞0.05）;向细胞中加入Noggin,观察ICA（20 ng/ml）与Noggin（100 ng/ml）共同培养MC3T3-E1细胞72 h后对细胞ALP活性的影响,与ICA（20 ng/ml）组相比,ICA+Noggin组细胞ALP活性受到抑制（p＜0.01）;与ICA（0 ng/ml）组相比无明显差异（p＞0.05）。4、Western blot结果显示,各组在培养48、72和96h后,10和20 ng/ml ICA组细胞BMP-2,BMP-2R,Smad1/5/8和Smad4蛋白表达水平较对照组均显著增加（p均＜0.01）,40 ng/ml ICA组细胞上述蛋白表达水平少量增多,但与对照组相比无显著差异（p＞0.05）;向细胞中加入Noggin（100 ng/ml）,观察不同浓度ICA与Noggin共同培养48、72和96h后对细胞BMP-2,BMP-2R,Smad1/5/8和Smad4蛋白表达的影响,结果显示加入Noggin后,细胞BMP-2,BMP-2R,Smad1/5/8和Smad4蛋白表达水平与对照组无显著差异（p＞0.05）。5、对PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳结果显示,与对照组相比,10和20 ng/ml ICA培养细胞72h后,Runx2 m RNA表达水平均显著增加（p＜0.05）,40 ng/ml ICA组细胞Runx2 m RNA表达水平少量增多,但与对照组无显著差异（p＞0.05）;向细胞中加入Noggin（100 ng/ml）,观察不同浓度ICA与Noggin共同培养72h后对细胞Runx2基因m RNA的影响,结果显示加入Noggin后,不同浓度ICA组中细胞Runx2基因m RNA表达水平与对照组无显著差异（p＞0.05）。结论:1、不同浓度的ICA对前体成骨细胞MC3T3-E1的形态无明显影响。2、10和20 ng/ml ICA组较对照组（0 ng/ml ICA）相比,细胞活性明显增高提示ICA可促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,并且其作用具有剂量及时间依赖性特点。3、通过对MC3T3-E1细胞ALP活性进行检测,发现10和20 ng/ml ICA组细胞ALP活性与对照组（0 ng/ml ICA）比较明显增强,其中20 ng/ml浓度组细胞在培养96 h后ALP活性最强,提示ICA可增加MC3T3-E1细胞ALP活性,并且其作用具有剂量及时间依赖性特点。4、通过Western blot对MC3T3-E1细胞BMP-2、BMP-2R、Smad1/5/8和Smad4蛋白表达量进行检测,10和20 ng/ml ICA组与对照组（0 ng/ml ICA）比较上述蛋白表达量均明显增强提示ICA可以增加成骨细胞BMP-2、BMP-2R、Smad1/5/8和Smad4蛋白表达。5、不同浓度ICA作用MC3T3-E1细胞72h后,10和20 ng/ml ICA组与对照组（0 ng/ml ICA）比较Runx2基因的转录水平均显著增加。6、用Noggin蛋白阻断BMP/Smads信号通路后,ICA促进MC3T3-E1细胞增殖及ALP活性的作用均受到明显抑制,同时BMP-2、BMP-2R、Smad1/5/8和Smad4蛋白表达量及Runx2基因转录水平均受到抑制。7、本实验结果表明ICA可能是通过上调MC3T3-E1细胞BMP-2蛋白的表达,激活BMP-2/Smads信号通路,启动下游成骨相关基因Runx2的表达,通过BMP-2/Smads/Runx2信号通路促进了MC3T3-E1细胞的增殖、分化。