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兔病毒性出血症是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus)引起的兔的一种传染病,其发病率和致死率都很高,是危害养兔业最为严重的一种疾病。但迄今为止兔出血症的诊断还没有一种理想的方法。兔病毒性出血症病毒的常规检测方法有血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、间接血凝试验(IHA)、琼脂扩散试验(AGP)、酶标抗体技术、RT-PCR等多种。这些方法普遍存在特异性差、耗时长、灵敏度低、易出现假阳性等问题,致使病原诊断始终是个难题,所以寻找一种快速准确的诊断方法显得尤为重要。实时荧光PCR技术是一种新型的核酸检测技术,在临床诊断中已经用于细菌、病毒及遗传性疾病的检测,具有极大的应用价值。本研究中的荧光探针即采用了Taqman探针的最新技术Taqman MGB探针,根据兔病毒性出血症病毒VP60基因的保守性设计一对引物及MGB探针来准确的检测病料中的病毒含量。本课题分为三个部分进行研究。试验一兔病毒性VP60蛋白部分基因的克隆该研究的目的是克隆出含扩增片段的质粒,并比较该病毒株与已发表序列的同源性。提取RHDV种毒RNA进行反转录,以反转录产物作为模板,利用设计的特异性引物进行PCR扩增,结果只有以RHDV种毒反转录产物为模板可以扩增出1201bp的特异条带。纯化产物与pUCm-T Vector连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选和PCR鉴定后,进行测序。结果表明该RHDV毒株的VP60蛋白基因序列与Genebank公布的序列有98%的同源性。该克隆的成功为标准曲线的绘制提供了阳性质粒。试验二荧光定量PCR检测方法的建立根据RHDV VP60衣壳蛋白的保守基因序列,设计了一对引物。在引物之间设计一段Taqman MGB探针,该探针5’端标记FAM,探针3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子。利用优化后的反应体系成功绘制了标准曲线,并对RHDV及相关兔常发病病原进行了实时荧光PCR检测。试验中能够检出的RHDV VP60基因质粒拷贝数达103数量级,能够检测到RHDV病毒核酸最低量可以达到5pg,未检出其它病原的RNA。试验结果表明建立的Taqman MGB探