芥子气,化学名二氯二乙基硫醚,属糜烂性化学战剂,1886年,纯品是由德国科学家梅耶首次合成,在第一次世界大战、第二次世界大战及两伊战争中被大规模使用,是通过战争考验的最有效的化学战剂之一,有“毒剂之王”之称。芥子气还是日遗化武的主要成分,2003年8月4日发生在齐齐哈尔的毒气事件元凶就是芥子气。芥子气合成工艺简单,战时恢复容易,平时恐怖威胁巨大,但是芥子气难防难治,目前临床上仅将芥子气皮肤中毒视为烧伤处理,进行对症治疗,没有特效解毒药物或方法。皮肤是芥子气沾染的首要毒性靶器官,是人体防御系统第一道屏障;皮肤分为表皮层和真皮层,表皮层主要由角质细胞组成,真皮层主要由成纤维细胞组成;氧化应激被认为是芥子气毒性作用的起始和关键环节之一,关于芥子气氧化应激毒性机制国内外均有报道,但是氧化应激在皮肤损伤中的具体机制仍不明确。因此从氧化应激与短时间入手,采用体外细胞模型探索皮肤细胞氧化应激相关机制,对芥子气早期防治有重要意义,本课题建立了两种人源皮肤细胞模型,并对两种细胞的不同反应性做了对比,关于Nrf2通路在芥子气中毒中的作用报道甚少,本课题发现Nrf2通路参与了hacat细胞对抗芥子气毒性作用,为以后芥子气机制研究及临床防治奠定基础。目的研究并比较芥子气对人皮肤不同类型细胞(成纤维细胞和角质细胞)的毒性作用及氧化应激机制,探讨氧化损伤在芥子气对人皮肤细胞毒性中的作用,为深入研究芥子气皮肤毒性机制奠定基础。方法采用胰酶消化法分离人皮肤真皮层成纤维细胞,获得稳定且纯度良好的成纤维细胞,建立成纤维细胞实验模型;采用CCK-8法检测芥子气对细胞增殖抑制的影响,获得细胞存活率及半数抑制浓度,反映芥子气的细胞毒性作用;采用DCFH-DA荧光探针染色方法及流式细胞仪检测细胞内活性氧含量,获得细胞活性氧剂量-效应关系,利用WST-8法检测细胞内SOD酶活力,获得SOD剂量-效应关系,利用MDA检测试剂盒检测丙二醛含量,获得MDA的剂量-效应关系,由此反映细胞氧化应激状态和程度;采用Annexin-PI荧光染色法检测芥子气对细胞凋亡的影响,获得细胞凋亡的剂量-反应关系,从而反映细胞的死亡结局;采用Western Blot检测抗氧化通路及细胞凋亡通路相关蛋白Nrf2、caspase-3及细胞色素C的表达情况。结果与讨论芥子气具有显著的细胞毒性作用。经过反复探索实验,成功建立了成纤维细胞模型,细胞纯化程度高,稳定性好;芥子气作用于成纤维细胞与hacat细胞24h,细胞存活率随芥子气浓度的增加而降低,前者半数抑制浓度为315μM,后者半数抑制浓度为112μM,说明芥子气具有显著的细胞毒性作用且具有剂量依赖性,hacat细胞相对成纤维细胞对芥子气更加敏感,对芥子气的耐受性差,由此我们推断细胞敏感性的不同可能是芥子气染毒导致皮肤起泡的原因之一。芥子气可诱导细胞发生氧化应激。芥子气作用成纤维细胞4h,细胞内ROS水平随芥子气浓度的增加显著增加,随着时间的延长,ROS增加趋势渐弱,24h ROS水平无显著性变化,芥子气处理成纤维细胞4h,细胞内SOD酶活力随芥子气浓度的升高而降低,MDA含量随芥子气浓度升高而增多,说明芥子气染毒后的成纤维细胞发生氧化应激,其抗氧化能力减弱并发生脂质过氧化;而芥子气作用hacat细胞24h,细胞内ROS水平显著增加并具剂量依赖性,细胞内SOD酶活力及MDA含量随芥子气浓度的升高而升高,其中SOD酶活力在成纤维细胞中随芥子气染毒剂量的升高而降低,但在hacat细胞中随芥子气染毒剂量的升高而升高,发生这种差异可能的原因是,hacat细胞发生氧化应激后,为抵御细胞内过量的ROS,细胞抗氧化能力代偿性增加。总之,芥子气可诱导细胞发生氧化应激且两种细胞氧化应激状态在时间上具有一定的差异性;芥子气可致发生脂质过氧化,氧化损伤的程度与芥子气浓度呈正相关。芥子气可诱导细胞发生细胞凋亡。细胞凋亡是细胞死亡结局之一,芥子气作用于两种细胞,细胞均发生凋亡,且凋亡率随着芥子气浓度的升高而升高,说明芥子气可诱导细胞发生凋亡。活性氧清除剂NAC可对抗芥子气对成纤维细胞的毒性作用。芥子气染毒细胞经过ROS清除剂NAC处理后,其存活率相对于芥子气处理组显著上升,说明NAC可对抗芥子气对成纤维细胞的毒性作用。Nrf2通路参与了hacat细胞对抗芥子气的抗氧化过程。Nrf2是细胞重要的抗氧化蛋白,芥子气作用于hacat细胞后,细胞内Nrf2表达量升高,25μM和100μM升高具有显著性差异,提示,Nrf2信号通路参与了细胞抗氧化过程。线粒体凋亡通路参与芥子气诱导hacat细胞凋亡。芥子气作用hacat细胞24h,Caspase-3前体表达量随芥子气浓度升高而降低,25μM和100μM浓度细胞内出现Caspase-3剪切体形式,说明胱天蛋白酶发生活化;细胞色素C在最高浓度时显著增加,说明线粒体释放细胞色素C,线粒体凋亡途径参与芥子气诱导细胞凋亡。结论本研究从细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡三方面入手,通过研究并比较芥子气对成纤维细胞及hacat细胞不同作用效应,得出以下结论:芥子气具有显著的细胞毒作用,并呈现剂量依赖性;不同浓度芥子气可诱导细胞发生不同程度的氧化应激,细胞发生脂质过氧化,其氧化损伤的程度与芥子气浓度呈正相关;芥子气可诱导细胞发生凋亡;Nrf2抗氧化通路参与了hacat细胞对抗芥子气的抗氧化过程;线粒体凋亡通路参与诱导hacat细胞凋亡。以上结论为深入研究芥子气氧化应激毒性机制奠定基础。真皮成纤维细胞与表皮角质细胞在细胞毒性和氧化应激等方面表现出一定的差异性,这种不同种类皮肤细胞反应性的不同或许可成为研究芥子气毒性特征的突破口。