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木质素(Lignin)是一种复合的芳香性高聚物,在植物生长发育过程中主要起机械支撑作用。草食类牲畜对苜蓿的消化利用除了可溶性蛋白外,主要是细胞壁中的纤维素、半纤维素等多糖类物质。但由于细胞壁中木质素的存在,严重阻碍了这些多糖类生物大分子在草食类牲畜瘤胃中的消化和吸收。咖啡酸-O-甲基转移酶(Caffeic acid O-methyltransfease,COMT)是一种邻位甲基转移酶,在木质素单体生物合成过程中发挥重要作用,其决定丁香酰基(S型)木质素单体的合成。由此可以通过抑制苜蓿中COMT表达来降低其木质素的含量。CRISPR/Cas9系统作为第三代基因组编辑技术,是一种可靠、简便、高效的基因组编辑工具。该系统能够通过转基因技术手段对作物自身基因组进行遗传操作,最终获得与天然突变体类似的种质新资源,在作物基因组编辑的研究中起着举足轻重的作用。基于以上原因,本研究以蒺藜苜蓿R108为研究对象,克隆MtCOMT基因,并利用基于毛状根培养系统的高效苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑平台,对R108中MtCOMT基因进行定点编辑,获得编辑纯合的毛状根根系,并再生出MtCOMT基因突变的苜蓿遗传资源,为苜蓿品质的遗传改良奠定分子基础。主要研究结果如下:1、蒺藜苜蓿MtCOMT基因克隆利用Phytozome资源数据库,获得蒺藜苜蓿MtCOMT基因的电子序列(基因号为Medtr3g092900),以此设计PCR引物进行植物克隆,以获得蒺藜苜蓿R108的Mt COMT基因。Mt COMT基因序列含有1098个核苷酸,编码365个氨基酸。该蛋白相对分子量为39.921KDa,理论等电点为5.67。利用NCBI protein BLAST分析,该蛋白在34-85氨基酸内有一个Dimerization结构域,在140-345氨基酸内有一个Methyltransf 2保守结构域,在Methyltransf 2结构域内含有S-腺苷甲硫氨酸结合位点。且发现蒺藜苜蓿MtCOMT和紫花苜蓿MsCOMT的亲缘关系高度相近,具有99.73%的同源性。两者在保守结构域内只有一个氨基酸的突变,在第80个氨基酸处丝氨酸被替换成亮氨酸。2、CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建根据蒺藜苜蓿MtCOMT基因的电子序列,在MtCOMT基因的第一、第二外显子上各设计了1个sgRNA靶点。在pYLCRISPR/Cas9-P35S骨架载体上连入适合双子叶植物发动sgRNA转录的AtU3b启动子和BsaI酶切位点,并引入2个tRNA保守序列,将2个20nt-sgRNA间隔开,将sgRNA和Cas9的表达盒组装在同一载体上。成功的构建了pYLCRISPR/Cas9-AtU3b-tRNA-COMT植物表达载体。3、编辑纯合毛状根根系的筛选利用发根农杆菌介导的叶圆盘转化法,将pYLCRISPR/Cas9-AtU3b-t RNACOMT植物表达载体转化蒺藜苜蓿,获得抗性毛状根。利用2×CTAB法提取具有抗性毛状根样品的DNA,以Cas9基因引物、Bar基因引物、RolB基因引物和MtCOMT基因引物分别进行PCR鉴定,阳性克隆进行BsaI酶切鉴定。经PCR/RE法鉴定,初步获得了3个编辑纯合的毛状根根系。将经酶切初步预判为纯合编辑的毛状根根系进一步测序分析。结果表明,这3种根系在第1靶点上均未发生突变,在第2靶点上均发生100%的突变,进一步证明所获得的3种毛状根根系为编辑纯合。4、编辑纯合毛状根根系的扩繁与再生将已鉴定获得的编辑纯合毛状根根系继续培养,使用诱导培养基将单一的毛状根根系扩大培养,为后续深入研究准备试验材料。同时,将部分编辑纯合毛状根转移到愈伤诱导、分化再生和生根培养基上,经过愈伤培养、分化再生并生根,最后获得了MtCOMT被编辑的蒺藜苜蓿再生植株。