目的本试验目的在于从体内试验、体外实验实验入手,研究参桃软肝胶囊治疗肝癌的机理。方法1.体外实验：制备低、中、高剂量含药血清,取处于对数增长期的肿瘤细胞,实验分为6组,即正常对照组,正常血清组,低剂量含药血清组,中剂量含药血清组,高剂量含药血清组和阳性对照组。采用MTT法检测含药血清对于HepG2人肝癌细胞增殖情况的影响；采用流式细胞术检测含药血清对HepG2人肝癌细胞的早期凋亡情况的影响；采用RT-PCR检测含药血清对HepG2人肝癌细胞内bax和bcl-2mRNA水平的影响；采用wb检测含药血清对细胞内bax、bcl-2和活化的caspase-3蛋白水平的影响。2.体内试验：建立H22荷瘤小鼠模型,将荷瘤小鼠随机分为五组,分别为阴性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组,每组8只。阴性对照组(生理盐水),低剂量组(参桃软肝胶囊混悬液0.35g/kg),中剂量组(参桃软肝胶囊混悬液0.7g/kg),高剂量组(参桃软肝胶囊混悬液1.4g/kg),阳性对照组(顺铂注射液2.0mg/kg),每天2次,共3周,停药后24小时取材。观察药物对荷瘤小鼠的抑瘤作用以及促进肿瘤组织内肿瘤细胞凋亡作用；检测荷瘤小鼠血浆及肿瘤组织内TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、检测荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞对H22细胞的杀伤活性、检测荷瘤小鼠外周血及脾脏淋巴细胞CD4+和CD8+细胞比例,以药物对荷瘤小鼠的免疫功能影响；针对肿瘤组织,采用免疫组化法检测CD34和VEGF水平、采用RT-PCR法检测bcl-2和bax mRNA水平、采用免疫组化检测活化的caspase-3水平、采用western blot方法检测bcl-2,bax和活化的caspase-3的蛋白水平,以探讨参桃软肝胶囊的抗肝癌机制。结果1.体外实验1.1参桃软肝胶囊含药血清作用于HepG,人肝癌细胞后,与用药前相比,形态发生改变,细胞数量减少。1.2含药血清对HepG2人肝癌细胞增殖的影响,正常大鼠的血清对人肝癌细胞HepG2的增殖没有明显的影响(P>0.05),低、中和高剂量含药血清和顺铂都能够明显抑制肝癌细胞的增殖(P<0.05)。其中,低、中和高剂量含药血清处理组随着血清中中药有效成分浓度的增加,抑制细胞增殖的能力逐渐加强,呈现一定的剂量依赖关系。1.3流式细胞术结果显示,普通培养的人肝癌细胞HepG2自然凋亡率比较低,约为5%-10%左右,正常的大鼠血清对HepG2细胞的凋亡没有明显的影响,低、中和高剂量含药血清和顺铂都能够明显诱导HepG2细胞的凋亡。1.4RT-PCR结果显示,正常大鼠的血清对人肝癌细胞HepG2胞内Bax和Bcl-2mRNA水平没有明显的影响(P>0.05),低中高剂量的含药血清和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax基因的转录(P<0.01),抑制Bcl-2基因的转录(P<0.01),明显上调Bax/Bcl-2基因的比值。其中低中高剂量含药血清组Bax mRNA水平的上调,Bcl-2mRNA水平的下调,同药物浓度呈现一定的剂量依赖关系。1.5western blot结果显示,正常大鼠的血清对人肝癌细胞HepG2胞内Bax、Bcl-2和活化的caspase-3蛋白水平没有明显的影响(P>0.05),低、中、高剂量的含药血清和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,明显上调Bax/Bcl-2蛋白的比值,活化caspase-3。其中,低、中、高剂量组中,随着药物浓度的增加,这种作用不断增强。2.体内实验2.1模型组肿瘤最大,重量最重；阳性对照组肿瘤最小,肿瘤最轻；低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组介于它们之间,随着药物浓度的增加,抑瘤效果不断增强,同模型组相比,各组瘤重明显的降低,具有显著差异(P<0.01)。2.2模型组小鼠肿瘤组织本身就存在一定的自然凋亡率,在2%-5%左右,低、中、高剂量给药处理和腹腔注射阳性化疗药物,都能够明显的在体内诱导肿瘤细胞的凋亡,细胞的凋亡率明显增加,其中以阳性对照组最为明显(50%-70%),其次为中药高剂量组(40%-60%),接着是中药中剂量组(30%-50%),最次是中药低剂量组(20%-30%)。2.3荷瘤小鼠血浆中细胞因子的含量明显的低于正常对照组(P<0.01),给予中药处理,随着药物浓度的增加,能够明显的增加血浆内细胞因子的含量,同模型组比,具有明显的差异(P<0.01)；阳性化疗药物处理的小鼠,血浆内这些细胞因子的含量并没有得到改善(P>0.05)。小鼠肿瘤组织内这些细胞因子的含量也有类似于血浆的趋势,中药组均能明显提高局部肿瘤组织内细胞因子的含量,从而改善机体的免疫状态,而阳性化疗药物则没有此作用。2.4同正常小鼠比,荷瘤小鼠外周血和脾脏T淋巴细胞中CD4+细胞比例明显降低,CD8+细胞比例明显升高,CD4+/CD8+的比值明显降低。中药低、中、高剂量组均能明显改善小鼠的细胞免疫功能(P<0.01),而阳性化疗药物则没有改善作用(P>0.05)。2.5同正常小鼠相比,荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞对H22细胞的杀伤活性明显减弱,中药低、中、高剂量组能够明显增强荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的杀伤活性(P<0.01),而且杀伤活性均高于正常非荷瘤小鼠。阳性化疗药物对荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的杀伤活性没有改善作用(P>0.05)。2.6同模型组,阳性对照组、中药低、中、高剂量组MVD计数明显减少,具有明显的统计学意义(P<0.01)；各组之间VEGF表达水平无明显差异。2.7中药低、中、高剂量组的中药和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax基因的转录(P<0.01),抑制Bcl-2基因的转录(P<0.01),明显上调Bax/Bcl-2基因的比值。其中低中高剂量组Bax mRNA水平的上调,Bcl-2mRNA水平的下调,同药物浓度呈现一定的剂量依赖关系。2.8模型组中,活化的caspase-3日性细胞比例最低,阳性对照组最高,低中高剂量中药处理组介于2者之间,呈现一定的剂量依赖关系。2.9低中高剂量的中药和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,明显上调Bax/Bcl-2蛋白的比值,其中低中高剂量组中,随着药物浓度的增加,这种作用不断增强。小鼠肿瘤组织内活化的caspase-3蛋白水平表达趋势也与上面免疫组化的结果类似,与模型组相比,低中高剂量组和阳性组小鼠肿瘤组织内活化的caspase-3蛋白水平明显增加,其中低中高剂量组中,活化的casapse-3蛋白水平的增加同剂量呈现一定的依赖关系。结论1.参桃软肝胶囊含药血清可能抑制HepG2人肝癌细胞生长,并诱导其凋亡。2.参桃软肝胶囊可能抑制H22肝癌小鼠肿瘤细胞生长,并诱导凋亡的作用。3.参桃软肝胶囊可能具有改善机体的免疫功能状态的作用。4.参桃软肝胶囊可能具有抑制肿瘤血管生成的作用。5.参桃软肝胶囊可能通过调节Bax/Bcl-2比值,活化casapse-3蛋白来实现抗肿瘤的作用。