背景近年来,治疗性血管新生(therapeutic angiogenesis)已成为缺血性血管疾病治疗的新方向,也是国际上最热点的研究领域之一。研究者们一直在寻找一种有效刺激新生血管形成的基因。低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor1, HIF-1)是调控血管新生的关键基因,它作为核转录因子,可直接或间接调控100多种下游靶基因的表达,这些基因参与了红细胞生成、细胞增殖、血管新生、糖代谢等多个病理生理过程。也有研究报道HIF-1通过上调Nix, BNip3及IL-20等促凋亡因子,导致线粒体功能失调、细胞死亡,在缺血再灌注损伤中发挥有害的作用。那么,通过调控HIF-1的活性减轻缺血诱导的细胞损伤,使其在缺血缺氧环境中发挥保护性的作用而避免其不利作用可能成为一个新的治疗靶点。因此,进一步探索HIF-1对下游靶基因的转录调控机制及效应有助于认识HIF-1在低氧适应性反应中的作用及机制。目前已经明确了HIF-1的结构和关键调控位点,它由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成的异二聚体。其中,HIF-1α是决定HIF-1能否发挥生物学活性的关键调节单位,其蛋白稳定性和转录活性受氧浓度的高度调节；HIF-1β呈组成性表达,不受氧浓度变化的调节。在低氧条件下,HIF-1α表达水平增加,与HIF-1p形成异二聚体进而发挥生物学功能。之所以HIF-1α稳定性和活性受氧浓度的调节,是由于HIF-1a含有氧依赖降解区(Oxygen Dependent Degradation Domain, ODDD)和转录激活区(TransactivationDomains)。常氧情况下,ODDD区Pro402和／或Pro564被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain, PHD)羟化后,被VHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor)肿瘤抑制蛋白复合物识别,经泛素蛋白酶途径降解。同时,HIF-1抑制因子(factor inhibiting HIF-la, FIH)与HIF-laC末端转录激活区(C-TAD)结合,通过803位点天冬酰胺残基(Asn803)的羟化,阻止C-TAD与辅助激活因子(CBP/p300)结合,从而抑制其转录活性。本课题组前期已将HIF-1α的564、402、803三个位点联合定点突变,成功构建了三突变型H1F-1α-Trip农达载体(pcDNA-(3.1+)-HIF-la-Trip),使其在常氧下能够稳定高效表达,为单因素研究HIF-1α基因的功能奠定了基础。p53RFP是新近发现的调控细胞增殖和凋亡的一个重要基因,受p53基因的调控,其产物具有E3泛素连接酶活性,通过泛素化降解凋亡重要启动信号p21WAF1参与细胞增殖和凋亡,从而参与细胞周期的调控。目前对这个基因的研究较少。本课题组在前期研究中发现HIF-1α表达增加时,p53RFP基因表达上调。因此,我们推测p53RFP可能在HIF-1a调节内皮细胞增殖凋亡的过程中发挥重要作用。在前期研究的基础上,本课题拟探索HIF-1α是否调控p53RFP基因表达及其对p53RFP基因转录调控的机制和效应。目的本研究拟构建p53RFP启动子区域不同长度片段的荧光素酶报告载体,深入研究HIF-1α对p53RFP基因的转录调控机制及效应。方法1、HEK293细胞、SW480细胞置于低氧培养箱(1%02,94%N2,5%CO2),采用荧光定量PCR、Western blot检测低氧处理0,6,12,24h不同时间点HIF-1αp53RFP mRNA及蛋白表达水平。HEK293细胞、SW480细胞给予DFO或COC12处理24h,荧光定量PCR检测p53RFP mRNA表达水平。HEK293细胞、SW480细胞给予不同浓度DFO处理24h, Western blot检测HIF-1α、p53RFP蛋白表达水平。HEK293细胞、SW480细胞瞬时转染三突变型HIF-1a真核表达载体(pcDNA3.1(+)-HIF-1α-Trip),转染24h后采用荧光定量PCR、Western blot检测HIF-1α、p53RFP mRNA及蛋白表达水平。2、应用基因克隆技术,构建p53RFP基因启动子区域不同片段长度的荧光素酶报告载体。将荧光素酶报告载体和三突变型HIF-1α质粒共转染HEK293细胞,检测HIF-1α高表达对p53RFP启动子活性的影响,并筛选出活性最强的启动子片段。3、应用基因定点突变技术,将低氧结合元件(HRE) CGTG突变为TACA,构建p53RFP基因启动子突变型的荧光素酶报告载体。将突变型荧光素酶报告载体和三突变型HIF-1α质粒共转染HEK293细胞,检测HRE突变是否影响HIF-1α对p53RFP启动子活性的调控,筛选出p53RFP基因启动子区域HIF-1α作用的核心调控元件。4、染色质免疫共沉淀验证HIF-1α是否直接结合于p53RFP基因启动子区域的核心调控元件,并验证HIF-1α对p53RFP基因的转录调控是否需要转录共刺激因子CBP/p300的参与。5、PCR扩增p53RFP基因的全部编码序列,克隆到pcDN A4/My c-His A,构建p53RFP的表达载体(pcDNA4-p53RFP); pcDNA4-p53RFP质粒转染SW480细胞,转染后48h, CCK-8检测p53RFP高表达对SW480细胞增殖有无影响；流式细胞检测p53RFP高表达对SW480细胞周期及细胞凋亡的影响。pcDNA4-p53RFP质粒转染SW480细胞,转染后24h,荧光定量PCR检测p53RFP过表达对Cyclin B1, CyclinD1, p21WAF1/yciP1及CDK1基因mRNA表达的影响。结果第一部分：随着细胞在低氧环境暴露时间的增长,HEK293和SW480两种细胞p53RFP mRNA表达量均呈逐渐增加的趋势。与0h mRNA表达量相比,HEK293细胞在低氧处理12h、24h后p53RFP mRNA表达量均有统计学差异(P=0.000,0.020); SW480细胞在低氧12h、24h后,与0hmRNA表达量相比,p53RFP mRNA表达量均有显著性差异(P=0.001,0.022)。随着低氧暴露时间的增长,在HEK293、SW480两种不同的细胞,p53RFP和HIF-1a蛋白均呈逐渐增加的趋势。HEK293细胞经DFO或COCl2处理后,p53RFP mRNA相对表达量显著高于空白组(P=0.000,0.017)；SW480细胞经DFO或COCl2处理后,p53RFP mRNA相对表达量亦显著高于空白组(P=0.000,0.001)。HEK293和SW480细胞经不同浓度DFO处理后,随着DFO浓度的逐渐增加,HIF-1和p53RFP蛋白表达量均逐渐增加,两种蛋白表达趋势一致。HEK293细胞转染三突变型HIF-1α表达载体24小时后,p53RFP mRNA表达水平较空载转染组显著增加(P=0.015),而空载组和空白组p53RFP mRNA表达量无显著性差异(P=0.362)；SW480细胞转染HIF-1α24小时后,p53RFPmRNA表达水平显著高于空载转染组(P=0.001)空载组和空白组p53RFP mRNA表达量无显著性差异(P=1.000)。HEK293、SW480细胞的空白组、空载组HIF-1α蛋白几乎无表达,三突变型HIF-1α转染组HIF-1α蛋白表达增加,p53RFP蛋白表达量较空白组和空载组相比也相应地增加。第二部分：构建了p53RFP基因启动子区域不同长度片段(1780bp,1230bp,780bp)的荧光素酶报告载体(pGL3-p1,pGL3-p2, pGL3-p3),测序结果经NCBIblast,与Genbank序列完全匹配。与空载组相比,HIF-1转染组pGL3-p1, pGL3-p2, pGL3-p3启动子活性分别增加2倍,5.4倍,3.4倍,差异具有统计学意义(P=0.000,0.000,0.000)。构建了HRE突变的荧光素酶报告载体(pGL3-p2M, pGL3-p2M2, pGL3-p3M)及pGL3-p2HRE2缺失载体(pGL3-p2-AHRE2)。 HRE2突变(pGL3-p2M)或缺失(pGL3-p2-AHRE2)显著抵消HIF-1α对pGL3-p2启动子活性的上调(P＝0.000,0.000)；而HRE3突变(pGL3-p3M)与pGL3-p3启动子活性无显著差异(P=0.953),同样,pGL3-p2M2与pGL3-p2M的启动子活性也无显著差异(P=0.355)。第三部分：染色质免疫共沉淀证实HIF-1a可直接结合于p53RFP基因启动子区域的HRE2、HRE3位点,不能与HRE2、 HRE3突变的启动子区域结合。转录共刺激因子p300可直接结合于HRE2位点,不能结合于HRE3位点。第四部分：克隆了p53RFP基因的全部编码序列,构建了p53RFP的表达载体(pcDNA4-p53RFP),基因测序结果经blast与Genebank基因序列完全匹配。pcDNA4-p53RFP转染SW480细胞,CCK-8结果显示p53RFP转染后第2、3、4天显著抑制细胞的增殖(P均<0.001)；流式细胞仪检测p53RFP转染SW480细胞48h后细胞周期的变化及细胞凋亡情况,结果显示p53RFP高表达组G2期细胞显著增加(P<0.05)；凋亡细胞数显著增加(P=0.006)。荧光定量PCR检测了p53RFP转染SW480细胞48h后Cyclin B1, CyclinD1p2lwAFI/Cip1及CDK1基因mRNA表达的变化。结果显示SW480细胞p53RFP高表达后,P21WAF1/Cipi基因表达显著增加(P＝0.043),其他基因表达无显著变化。结论第一部分：低氧可能通过稳定HIF-1α的表达诱导p53RFP基因表达。第二部分：HIF-1a显著上调p53RFP基因启动子活性,对pGL3-p2的活性影响最大。第三部分：HIF-la通过与启动子区域HRE2相互作用发挥对p53RFP基因的转录调控,且这一过程需要转录共刺激因子p300的参与。第四部分：p53RFP高表达可能通过上调p21WAF1/Cipi基因表达而抑制SW480细胞增殖,使细胞G2期阻滞,增加细胞凋亡。